Турбидиметрический анализ лизата амебоцитов лимулюса: метод обнаружения и количественной оценки загрязнения эндотоксинами в нанопрепаратах

Аннотация

Источник: Neun, B. W. et al., Обнаружение эндотоксина в наносоставах с использованием анализов лизата амебоцитов Limulus (LAL). J. Vis. Exp. (2019)

Это видео описывает турбидиметрический формат анализа лизата амебоцитов Limulus, или LAL, для оценки контаминации эндотоксинов в наноформах ПЭГилированного липосомального доксорубицина. Помутнение раствора после реакции эндотоксина с реагентом LAL позволяет оценить содержание эндотоксина в образце.

Протокол

1. Подготовка образцов наночастиц

1. Подготовьте образец для исследования в воде класса LAL.
2. Если pH образца находится за пределами диапазона 6-8, отрегулируйте pH с помощью гидроксида натрия, не содержащего пирогенов, или соляной кислоты.
3. Используя воду марки LAL, готовят несколько разбавлений исследуемого образца. Следите за тем, чтобы максимальное разведение не превышало максимально допустимое разведение (MVD).

2. Получение реагентов, общих для форматов LAL

1. Концентрированный гидроксид натрия разбавляют в воде реагента LAL без пирогена для приготовления рабочего раствора в концентрации 0,1 Н.
2. Концентрированное сырье соляной кислоты разбавить в воде реагента ЛАЛ, не содержащей пирогенов, и приготовить рабочий раствор в конечной концентрации 0,1 Н.
3. Приготовление контрольного стандартного эндотоксина (CSE)
   1. Восстановите CSE в соответствии с сертификатом анализа, предоставленным производителем.
      заметка: Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о номере по каталогу и применении данной формулировки CSE в различных форматах LAL.
4. Приготовление реагента LAL
   1. Восстановите реагент LAL в соответствии с сертификатом анализа, предоставленным производителем.
      заметка: Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о каталожном номере и применении конкретной рецептуры реагента LAL в различных форматах LAL.

3. Анализ мутности LAL

1. Подготовка калибровочных стандартов
   1. Используя 900 мкл воды класса LAL и 100 мкл CSE, приготовьте столько промежуточных разбавлений, сколько необходимо, чтобы можно было подготовить калибровочный стандарт с диапазоном концентраций от 0,001 до 1 EU/мл.
   2. Сначала нанесите этикетку на пробирки и добавьте в каждую пробирку 900 μл воды класса LAL. Затем добавьте 100 мкл раствора 10 EU/мл для приготовления калибровочного стандарта с концентрацией 1EU/мл.
   3. Повторите последовательное 10-кратное разбавление, как описано выше, чтобы подготовить три нижних калибровочных стандарта. Убедитесь, что подготовлены четыре калибровочных стандарта в диапазоне от 0,001 до 1 EU/мл.
2. Подготовка к контролю качества
   1. Приготовьте контроль качества 0,05 EU/мл, смешав 50 μL раствора CSE 1 EU/мл с 950 μL воды класса LAL.
3. Подготовка средств управления торможением/усилением (IEC)
   1. Приготовьте МЭК с концентрацией 0,05 ЕС/мл путем объединения 25 мкл раствора CSE 1 ЕЕ/мл и 475 мкл испытуемого наноматериала при заданном разбавлении.
4. Экспериментальная методика
   1. Дайте инструменту нагреться, включив его примерно за 30 минут. Установите длину волны детектирования на 660 нм, так как это подходит для мутности LAL.
   2. Войдите в систему, введя имя пользователя и пароль.
   3. Откройте программу (Table of Materials), нажав на соответствующую иконку на экране компьютера.
   4. Выберите «Собирать данные» на главном экране программного обеспечения. Введите идентификатор теста и информацию о группе данных в соответствующее поле на вкладке «Общие» на главном экране.
   5. Перейдите на вкладку «Оборудование». Выберите тип инструмента в раскрывающемся меню.
   6. Установите длину волны детектирования на 660 нм, так как это соответствует мутности LAL, выбрав метод мутности LAL.
   7. Убедитесь, что на экране отображается серийный номер, идентификатор системы и информация о последовательном порте. Нажмите OK. Нажмите OK еще раз для подтверждения.
   8. Введите идентификатор образца в том же порядке, в котором тестируется образец. Используйте кнопки по умолчанию для ввода отрицательных контрольных, стандартных кривых и тестовых образцов.
   9. Подготовьте дубликаты пробирок для каждого образца и добавьте 200 мкл (тестовое соотношение 4:1) или 100 мкл (тестовое соотношение 1:1) отрицательного контроля (вода), калибровочные стандарты, контроль качества, IEC и тестовые наночастицы в предварительно маркированные стеклянные пробирки.
   10. Добавьте 50 μL (тестовое соотношение 4:1) или 100 μL (тестовое соотношение 1:1) реагента LAL в первый тестовый флакон, кратковременно перемешайте его и вставьте в тестовое отверстие в карусели инструмента. Если используется соотношение 1:1, то объем реагента LAL составляет 100 μл.
   11. Повторите описанную выше процедуру для других образцов. Обрабатывайте образцы по одному.
        

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Гидроксид натрия	сигма	С2770	При необходимости он используется для регулировки pH образца в диапазоне 6-8
соляная кислота	сигма	Н9892	При необходимости он используется для регулировки pH образца в диапазоне 6-8
Реагент LAL	Партнеры Кейп-Кода	Т0051	Этот реагент можно использовать только с анализом на мутность
Контроль стандарта эндотоксина	Партнеры Кейп-Кода	Е0005	Этот реагент можно использовать при анализе на мутность и гель-сгусток
Вода класса LAL	Партнеры Кейп-Кода	РГ0501	Этот реагент можно использовать с любым форматом LAL
Буфер Glucashield	Партнеры Кейп-Кода	ГБ051-25	Используется для предотвращения ложноположительного ответа на бета-глюканы
Одноразовые стеклянные пробирки для разбавления стекла без эндотоксинов 12 x 75 мм	Партнеры Кейп-Кода	ТБ240	Эти пробирки можно использовать со всеми тремя анализами
Стеклянные реакционные пробирки одноразовые без эндотоксинов 8 x 75 мм	Партнеры Кейп-Кода	ТК100	Эти пробирки можно использовать для анализа мутности и хромогенных анализов
Безпирогенные насадки объемом 0,25 и 1,0 мл	РАЙНИН	ППТ25, ППТ10	Наконечники и пипетки могут адсорбировать эндотоксин и высвобождать выщелачиваемые вещества, которые мешают анализу LAL. Эти наконечники RAININ используются потому, что их оптимальная производительность в анализе LAL была проверена и подтверждена
Безпирогеновые микроцентрифужные пробирки, 2,0 мл	Эппендорф	22600044	Можно использовать и другие равноценные расходные материалы
Пироген-фи комбитипы, 5мл	Эппендорф	30089669	Можно использовать и другие равноценные расходные материалы
Повторяющийся пипет	Эппендорф	4982000020	Можно использовать и другие равноценные расходные материалы
Микроцетрифуга	любой бренд		Можно использовать любую марку
Холодильник, 2-8 С	любой бренд		Можно использовать любую марку
вихрь	любой бренд		Можно использовать любую марку
Морозильная камера, -20 С	любой бренд		Можно использовать любую марку
Считыватель Pyros Kinetix или Pyros Kinetix Flex	Партнеры Кейп-Кода	ПКФ96	Можно использовать и другие инструменты. Тем не менее, реагенты LAL и стандарты эндотоксинов, используемые в этом анализе, могут потребовать оптимизации. При использовании других приборов обратитесь к производителям приборов и комплектов LAL для получения инструкций