Анализ лизата амебоцитов Gel-Clot Limulus: метод обнаружения бактериального эндотоксина в составах наночастиц

Аннотация

Источник: Neun, B. W. et al., Обнаружение эндотоксина в наносоставах с использованием анализов лизата амебоцитов Limulus (LAL). J. Vis. Exp. (2019).

Это видео описывает анализ гелевых сгустков для определения присутствия бактериальных эндотоксинов в наносоставах с использованием лизата амебоцитов Limulus, полученного из клеток крови мечехвостов. Анализ помогает проверить загрязнение эндотоксинами фармацевтических продуктов, в том числе нанопрепаратов.

Протокол

1. Подготовка образцов наночастиц

1. Подготовьте образец для исследования в воде класса LAL.
2. Если pH образца находится за пределами диапазона 6-8, отрегулируйте pH с помощью гидроксида натрия, не содержащего пирогенов, или соляной кислоты.
3. Используя воду марки LAL, приготовьте несколько разведений исследуемого образца. Следите за тем, чтобы максимальное разведение не превышало максимально допустимое разведение (MVD).

2. Получение реагентов, общих для форматов LAL

1. Концентрированный гидроксид натрия разбавляют в воде реагента LAL без пирогена для приготовления рабочего раствора в концентрации 0,1 Н.
2. Концентрированное сырье соляной кислоты разбавить в воде реагента ЛАЛ, не содержащей пирогенов, и приготовить рабочий раствор в конечной концентрации 0,1 Н.
3. Приготовление контрольного стандартного эндотоксина (CSE)
   1. Восстановите CSE в соответствии с сертификатом анализа, предоставленным производителем.
      заметка: Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о номере по каталогу и применении данной формулировки CSE в различных форматах LAL.
4. Приготовление реагента LAL
   1. Восстановите реагент LAL в соответствии с сертификатом анализа, предоставленным производителем.
      заметка: Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о каталожном номере и применении той или иной рецептуры реагента LAL в различных форматах LAL.

3. Гель-сгусток LAL

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ определяет наличие эндотоксинов в образце на основе визуального наблюдения и обнаружения сгустка в реакционной пробирке. Этапы эксперимента описаны ниже. Используйте таблицу для записи результатов. Этот стендовый лист не является обязательным, и другие способы фиксации результатов анализа также допустимы. Пример такого стендового листа приведен в дополнительных материалах для удобства читателя. Лямбда (л) — это чувствительность анализа гелевых сгустков и составляет 0,03 ЕУ/мл.

1. Маркируйте столько реакционных пробирок, сколько необходимо, чтобы вместить количество анализируемых образцов. Обратитесь к таблице таблиц для получения подробной информации о количестве повторов, использованных на этапах 1, 2 и 3 анализа.
2. Аликвота на 100 μл воды, контрольной или испытуемой пробирки на пробирку.
3. Приготовьте CSE таким образом, чтобы конечная концентрация была равна 4λ.
4. Смешайте 100 μл упомянутого выше стандарта со 100 μл воды или испытуемого образца для достижения конечной концентрации CSE 2λ. Повторите еще три раза, чтобы получить лямбду и половину лямбды и четверть лямбды.
5. Следите за тем, чтобы температура на водяной бане составляла 37 °C.
6. Добавьте 100 мкл лизата на пробирку, быстро перемешайте и поместите штатив со всеми пробирками на водяную баню на 1 ч.
7. Плавными движениями переверните трубку.
8. Вручную запишите результаты с помощью «+» (твердый сгусток) или «-» (без сгустка или рыхлого сгустка) на листе скамьи.
9. Проведите анализ в соответствии с USP BET 85; используйте лист запаса в качестве вспомогательного материала.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагент LAL	Партнеры Кейп-Кода	Г5003	Этот реагент специфичен для анализа гелевого сгустка
Контроль стандарта эндотоксина	Партнеры Кейп-Кода	Е0005	Этот реагент можно использовать при анализе на мутность и гелевый сгусток
Гидроксид натрия	сигма	С2770	При необходимости он используется для регулировки pH образца в диапазоне 6-8
соляная кислота	сигма	Н9892	При необходимости он используется для регулировки pH образца в диапазоне 6-8
Вода класса LAL	Партнеры Кейп-Кода	РГ0501	Этот реагент можно использовать с любым форматом LAL
Буфер Glucashield	Партнеры Кейп-Кода	ГБ051-25	Используется для предотвращения ложноположительного ответа на бета-глюканы
Одноразовые стеклянные пробирки для разбавления стекла без эндотоксинов 12 x 75 мм	Партнеры Кейп-Кода	ТБ240	Эти пробирки можно использовать со всеми тремя анализами
Стеклянные реакционные пробирки одноразовые без эндотоксинов 10 x 75 мм	Партнеры Кейп-Кода	ТС050	Эти пробирки предназначены для использования с анализом гелевых сгустков
Безпирогенные типсы объемом 0,25 и 1 мл	РАЙНИН	ППТ25, ППТ10	Наконечники и пипетки могут адсорбировать эндотоксин и высвобождать выщелачиваемые вещества, которые мешают анализу LAL. Эти наконечники RAININ используются потому, что их оптимальная производительность в анализе LAL была проверена и подтверждена
Безпирогеновые микроцентрифужные пробирки, 2,0 мл	Эппендорф	22600044	Можно использовать и другие равноценные расходные материалы
Пироген-фи комбитипы, 5мл	Эппендорф	30089669	Можно использовать и другие равноценные расходные материалы
Повторяющийся пипет	Эппендорф	4982000020	Можно использовать и другие равноценные расходные материалы
Микроцетрифуга	Любой бренд		Можно использовать любую марку
Холодильник, 2-8° C	Любой бренд		Можно использовать любую марку
вихрь	Любой бренд		Можно использовать любую марку
Морозильная камера, -20 С	Любой бренд		Можно использовать любую марку
Водяная баня, 37° C	Любой бренд		Можно использовать любую марку, однако важно либо отключить циркуляцию воды, либо использовать нециркуляционную водяную баню, потому что поток воды повлияет на образование тромбов и приведет к ложноотрицательным результатам