$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Активация пластины пробирного набора
- Активируйте планшет с 96-луночным фильтром (содержащим синий CPH-ксилан) (Список материалов) путем добавления 200 мкл раствора активации (полученного вместе с набором) в каждую лунку с последующей 10-минутной инкубацией при комнатной температуре без перемешивания.
- Подайте вакуум с помощью вакуумного коллектора (с распорным блоком внутри и любой стандартной прозрачной 96-луночной пластиной в качестве сборной пластины) для удаления существующего раствора активации. Для этого этапа также можно использовать центрифугу при давлении 2 700 x g в течение 10 мин вместо вакуумного коллектора.
- Промойте подложки CPH, добавив 100 μл стерильной воды, и примените вакуум (или центробежную силу) для удаления стабилизатора. Повторите этот шаг еще два раза, и пластины готовы к использованию.
2. Ферментная реакция
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда включайте только буфер в качестве отрицательного контроля и, если возможно, ранее охарактеризованные ферменты как положительные контролры. Используйте статистически соответствующее количество реплик. Субстраты CPH стабильны в диапазоне pH от 3,0 до 10,0, а общий объем раствора буферного конечного фермента в каждой лунке не должен превышать 180 мкл. Растительный экстракт или отвар культуры также можно использовать вместо очищенного ферментного раствора.
- Добавьте 150 мкл 100 мМ буфера ацетата натрия, pH 4,5 и 5 мкл раствора эндоцеллюлазы (до конечной концентрации 1 Ед/мл) в каждую лунку планшета для анализа.
- Поместите планшет с продуктом (планшет с прозрачным колодцем, совместимый со считывателем планшетов для микротитрования) под планшет для анализа для сбора любой потенциальной утечки из реакционного планшета во время встряхивания.
- Инкубируйте планшет для пробирного набора при температуре 25 °C в течение 30 минут в горизонтальном вибростенде при 150 об/мин.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Смешивание реакции в планшете набора для анализа во время инкубации имеет решающее значение для достижения стабильного и воспроизводимого результата. Субстраты CPH стабильны до 90 °C. Время инкубации следует увеличить до 24 ч при испытании питательных бульонов, содержащих неизвестные концентрации ферментов, с субстратами CPH. Обратите внимание, что подходящее время инкубации зависит от активности фермента (ферментов), но в целом, если в течение 24 часов не обнаруживается активность, вполне вероятно, что фермент не будет разрушать исследуемый субстрат. Активный фермент разлагает нерастворимые хромогенные полисахариды субстрата CPH на растворимые хромогенные олигосахариды, которые видны как окрашенная надосадочная жидкость.
- Поместите чистую пластину с продуктом внутрь вакуумного коллектора с распорным блоком внутри.
- Поместите сверху пластину с пробирным набором и подайте вакуум (максимальное отрицательное давление -60 кПа). Также можно использовать центрифугу при давлении 2 700 x g в течение 10 мин.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрат, содержащий цветные олигосахариды в качестве продукта реакции, теперь находится в пластине продукта для дальнейшего анализа.
3. Обнаружение и количественная оценка
- При визуальном осмотре убедитесь, что объем жидкости в каждой лунке продуктовой пластины примерно одинаков.
- Считывание поглощения сборной пластины на длине волны 595 нм для синего CPH-ксилана с помощью считывателя пластин.
- При анализе данных вычтите отрицательные контрольные значения только для буфера из значений из лунок, в которые был добавлен фермент. Расчет среднего значения и стандартной погрешности средних (SEM) по реплицируемым скважинам.