1. Хромогенный анализ с субстратами ICB в формате 96 лунок
- Ферментная реакция
- Добавьте 150 мкл 100 мМ ацетата натрия буфера, pH 4,5 и 5 мкл 31 Ед/мл раствора эндо-ксиланазы в каждую лунку планшета для анализа, содержащую красную пшеничную солому ICB (конечная концентрация фермента в лунке: 1 Ед/мл).
заметка: Планшеты для анализа (96-луночные фильтрующие пластины, содержащие субстраты ICB) изготавливаются в соответствии с литературными описаниями (см. Список материалов). Субстраты ICB стабильны в буферах с pH в диапазоне pH от 3,0 до 10,0. Всегда включайте только буфер в качестве отрицательного контроля, коммерческие ферменты в качестве положительного контроля и используйте статистически соответствующее количество реплик.
- Не активируйте субстраты ICB, как подложную пластину CPH, а удалите стабилизатор, трижды промыв водой объемом 100 мкл с последующей вакуумной фильтрацией или центрифугированием.
- Поместите пластину с продуктом под пластину подложки, чтобы собрать любую потенциальную утечку из пластины подложки во время встряхивания.
- Инкубируйте реакцию при 25 °C, встряхивая при 150 об/мин, в течение 2 ч<бр/>
заметка: Активный фермент разрушает нерастворимые хромогенные полисахариды в субстрате ICB до растворимых олигосахаридов, которые видны как окрашенные надосадочные жидкости. Субстраты ICB стабильны при температуре до 90 °C. Время инкубации должно быть увеличено до 24 часов, если используются неочищенные ферменты, такие как культуральные бульоны.
- Поместите пластину с продуктом внутрь вакуумного коллектора с распорным блоком внутри.
- Поместите планшет с набором для анализа сверху и подайте вакуум (максимальное отрицательное давление -60 кПа) или используйте центрифугу для фильтрации продукта из планшета набора для анализа в лунку пластины с продуктом.
заметка: Фильтрат, содержащий цветные олигосахариды в качестве продукта реакции, теперь находится в сборной тарелке для дальнейшего анализа.
2. Обнаружение и количественная оценка
- При визуальном осмотре убедитесь, что объем жидкости в каждой лунке сборной пластины примерно одинаков.
- Считывание абсорбции сборной пластины при 517 нм для красной ICB-пшеничной соломы с помощью считывателя пластин.
- При анализе данных — вычитаем буфер — только отрицательные контрольные значения из значений из лунок, куда был добавлен фермент. Рассчитать среднее значение и стандартную погрешность средних (СЭМ) из реплицируемых скважин.
заметка: В случае скрининга неизвестных ферментов мы предлагаем провести ряд разведения с целью получения более детальных данных о динамическом диапазоне активности фермента.
