1. Анализ цитотоксичности: настройка
- Готовьте растворы представляющих интерес соединений в желаемых концентрациях в соответствующих средах (без сыворотки или 1, 2,5 или 5% FBS RPMI-1640).
- Чтобы измерить цитотоксичность одного соединения (например, определить эффективные дозы), готовят соединения в 2-кратной конечной концентрации.
- Чтобы измерить цитотоксичность комбинаций соединений, готовьте соединения в 4-кратной конечной концентрации.
- Приготовьте средства контроля, содержащие только растворители, смешав такое же количество растворителя с соответствующей средой. Например, при тестировании соединений, растворенных в ДМСО и метаноле, проводите контроль только растворителя для каждого растворителя.
- Соберите клетки из чашки для культивирования или колбы в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Перелейте 10 μL клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку и окрасьте 10 μL 0,4% трипановым синим. Используйте гемоцитометр для подсчета жизнеспособных и нежизнеспособных клеток для каждого источника клеток.
- Пеллетные ячейки по 200 г в течение 5 мин. Аспират или декант надосадочной жидкости.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в подходящей для анализа среде (без сыворотки или 1, 2,5, 5% FBS RPMI-1640) при плотности клеток 3*105 клеток/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ 1: Плотность ячеек 3*105 клеток/мл обеспечивает плотность затравки 15 000 клеток/лунку. Плотность заделки семян является важным параметром и в идеале должна быть заранее определена до начала эксперимента. Плотность засева должна учитывать: 1) размер ячеек – обычно более крупные ячейки засеваются с меньшей плотностью; 2) продолжительность лечения – клетки обычно засеиваются с более низкой плотностью для экспериментов, которые будут длиться дольше, и 3) скорость деления клеток – клетки с более высокой скоростью деления засеваются с более низкой плотностью. Конкретные примеры оптимизированных плотностей затравки: ячейки K562, больше, продолжительность 24 ч – 10 000 ячеек/лунка; Клетки MOLM-13, умеренные размеры, обработка 24 часа – 15 000/лунка; клетки MOLM-13, обработка 48 ч – 8 000/лунка; малые здоровые мононуклеарные клетки периферической крови (ПМЦ), 24-часовое лечение – 50 000/лунка; первичные клетки ОМЛ, 24 ч лечение – 15 000-20 000/скважина<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ 2: Присутствие FBS в среде может влиять на активность соединений. Снижение концентрации FBS может упростить интерпретацию результатов анализа, но также снижает физиологическую точность.
- Засейте 50 мкл клеточной суспензии с шага 1,5 в каждую лунку 96-луночного планшета с помощью многоканальной пипетки.
- Добавьте соединения следующим образом:
- Для анализа одного соединения добавьте 50 мкл 2x раствора соединения в каждую лунку. Для лунок для контроля растворителей добавьте 50 μл тестовой среды, содержащей растворитель в концентрации 2x.
- Для комбинированных анализов добавьте по 25 мкл каждого из соединений (4 раствора) в каждую лунку. Для одиночных контрольных лунок добавьте 25 мкл 4-кратного раствора компаунда и 25 мкл исследуемой среды. Для лунок для контроля растворителей добавьте 50 μл испытательной среды или испытательной среды, содержащей растворитель.
ПРИМЕЧАНИЕ 1: Конечная концентрация ДМСО не должна превышать 0,5%.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ 2: Из-за малого объема рекомендуется добавлять среды, содержащие соединения, при соприкосновении пипетки со стенкой каждой лунки.
- Аккуратно постучите по пластине, чтобы обеспечить перемешивание содержимого лунок.
- Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C во влажной атмосфере с содержаниемCO2 5% в течение соответствующего времени, например, 24 часа.
2. Анализ цитотоксичности: окрашивание Hoechst 33342 и йодидом пропидиума
- Приготовьте 10-кратный раствор для окрашивания. Такой раствор нужно готовить свежим перед каждым экспериментом, хранить его нельзя. Окончательные концентрации красителя должны быть определены до начала эксперимента.
- Для клеточных линий лейкемии и первичных лейкозных клеток 1 мл 10-кратного окрашивающего буфера содержит 10 мкл 20 мМ Hoechst 33342 и 50 мкл 1 мг/мл йодида пропидия в стерильных PBS (конечные концентрации: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μг/мл).
- Для здоровых PBMC 1 мл 10x окрашивающего буфера содержит 10 мкл 20 мМ Hoechst 33342 и 10 мкл 1 мг/мл йодида пропидия в стерильных PBS (конечные концентрации: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μг/мл).
заметка: Окончательная концентрация йодида пропидия должна быть определена до начала экспериментов. Клетки должны быть протестированы с использованием диапазона концентраций PI (1, 2,5, 5 мкг/мл), а затем жизнеспособность, рассчитанная по методу Hoechst/PI, должна быть сравнена с жизнеспособностью, измеренной с помощью трипанового синего. Перечисленные выше концентрации PI были выбраны на основе жизнеспособности клеток-мишеней в лунках для контроля среды (выше ~90% для клеточных линий лейкемии, выше ~70% для здоровых PBMC).
осторожность: Hoechst 33342 и йодид пропидиума являются потенциальными канцерогенами. При обращении с ними надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты.
- После инкубации с помощью многоканальной пипетки добавьте в каждую лунку 10 мкл 10-кратного окрашивающего буфера.
заметка: Чтобы предотвратить перекрестное загрязнение, следите за тем, чтобы наконечники пипеток не касались среды.
- Аккуратно постукивайте по тарелке, чтобы перемешать и очистить пузырьки. Окрашивать при температуре 37 °C в течение 15 минут.
- Центрифугируйте планшет при нагрузке 200 г в течение 4 минут, чтобы довести все клетки до дна планшета. Осторожно протрите нижнюю часть пластины влажной салфеткой, чтобы удалить волокна и/или мусор, которые могут помешать визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ 1: Центрифугирование планшета обеспечивает максимальные шансы на то, что все клетки будут запечатлены на изображении. Часто мертвые клетки отделяются и плавают, обеспечивая вводящие в заблуждение значения цитотоксичности. Центрифугирование смягчает этот эффект.
ПРИМЕЧАНИЕ 2: Изображение планшета должно быть получено как можно быстрее после центрифугирования, в идеале в течение 15 минут. Центрифугирование может снизить селективность окрашивания PI и может позволить клеткам медленно накапливать йодид пропидия. Повышение точности, полученное за счет визуализации мертвых клеток, перевешивает небольшое увеличение окрашивания PI
