Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Выделение эритроцитов из цельной крови
- Добавьте 500 μл цельной крови в кислом цитрате декстрозе (ACD) (хранящемся при 4 °C) в микроцентрифужную пробирку.
заметка: Цельная кровь была куплена в ACD. По данным компании, в 7 мл цельной крови (общий объем 8,5 мл) добавляется 1,5 мл АКД.
- Центрифугируйте цельную кровь при давлении 700 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT) и удалите прозрачную плазму и тонкую охристую оболочку с помощью пипетки, чтобы оставить красный слой эритроцитов.
- Приготовьте 1 л раствора Рингера, содержащего 125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgSO4, 32 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы и 1 мМ CaCl2. Отрегулируйте pH до 7,4, добавив 2 мкл капель 1,0 М NaOH. Чтобы приготовить безглюкозный раствор Рингера, следуйте тому же протоколу, но не включайте глюкозу в раствор.
- Промойте эритроциты 2 раза в растворе Рингера, суспендировав клеточную гранулу в 1,5 мл раствора Рингера, центрифугируя при 700 х г в течение 5 минут при РТ и удалив надосадочную жидкость.
- Получить 0,4% гематокрит путем ресуспендирования 40 мкл гранулы эритроцитов в 9 960 мкл безглюкозного раствора Рингера до достижения конечного объема 10 мл<бр/>
заметка: Гематокрит — это термин, используемый для обозначения объемной доли эритроцитов в суспензии. 0,4% гематокрит представляет собой суспензию, содержащую 0,4% эритроцитов.
- Инкубировать клеточную суспензию при 37 °С в течение 7 дней.
2. Лечение эритроцитов иономицином и измерение гемолиза
- Растворите 1 мг иономициновой кальциевой соли в 630 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) до достижения конечной концентрации 2 мМ. Аликвот и хранить при температуре -20 °C.
- Возьмите 1 мл 0,4% гематокрита из стадии 1,5 и добавьте 0,5 мкл 2 мМ иономицина до достижения конечной концентрации 1 мкМ. Инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C. Инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C.
- Используйте 1 мл гематокрита без лечения иономицином в качестве отрицательного контроля.
- Центрифугируйте обработанные иономицином и необработанные гематокриты при 700 x g в течение 5 мин в режиме ОТ и удалите их надосадочную жидкость, чтобы клеточные гранулы остались на дне пробирок.
- Промойте ячейки 3 раза раствором Рингера, суспензив гранулы клеток в 1,5 мл раствора Рингера, центрифугируя при 700 х г в течение 5 минут при РТ и выбросив надосадочную жидкость.
- Для измерения гемолиза добавьте 1 мл необработанного 0,4% гематокрита со стадии 1,5 в микроцентрифужную пробирку и инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C в качестве отрицательного контроля для гемолиза (0%).
- Добавьте 1 мл необработанного 0,4% гематокрита из стадии 1,5 в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте при 700 x g в течение 5 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл дистиллированной воды в клеточную гранулу и инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C в качестве положительного контроля гемолиза (100%).
- Добавьте 1 мл обработанного иономицином 0,4% гематокрита с шага 2.2 в микроцентрифужную пробирку.
- Центрифугируйте необработанные клетки, обработанные клетки и клетки в дистиллированной воде при 700 x g в течение 5 минут при RT.
- Возьмите 200 мкл надосадочной жидкости и добавьте в 96-луночный планшет.
- Измерьте поглощение на длине волны 541 нм с помощью считывателя микропланшетов.
- Рассчитайте гемолиз с помощью уравнения 1:
%Гемолиз = (AT - A0)/(A100 - A0)*100
где А0 – абсорбция эритроцитов в растворе Рингера, А100 – абсорбция эритроцитов в воде, а АТ – абсорбция обработанных эритроцитов иономицином.
