Анализ связывания аннексина V: флуоресцентный метод идентификации апоптотических эритроцитов с помощью мечения фосфатидилсерином

Аннотация

Источник: Bigdelou, P., et al. Индукция эритоза в эритроцитах с использованием ионофора кальция. J. vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем анализ связывания Аннексина V для измерения степени эриптоза, запрограммированной гибели клеток эритроцитов, с использованием флуоресцентного окрашивания Аннексином V. Апоптотические эритроциты демонстрируют транслокацию фосфатидилсерина от внутреннего к внешнему листку клеточной мембраны, в результате чего меченный флуорофором аннексин V связывается с транслоцированным фосфатидилсерином, тем самым излучая флуоресцентный сигнал.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Анализ связывания аннексина-V

1. Растворите 1 мг иономициновой кальциевой соли в 630 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) до достижения конечной концентрации 2 мМ. Аликвот и хранить при температуре -20 °C.
2. Возьмите 1 мл 0,4% гематокрита и добавьте 0,5 мкл 2 мМ иономицина, чтобы достичь конечной концентрации 1 μМ. Инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C. Инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C.
3. Центрифугируйте обработанные иономицином и необработанные гематокриты при 700 x g в течение 5 мин при РТ и удалите их надосадочную жидкость, чтобы клеточные гранулы остались на дне пробирок.
4. Промойте ячейки 3 раза раствором Рингера, суспензив гранулы клеток в 1,5 мл раствора Рингера, центрифугируя при 700 х г в течение 5 минут при РТ и выбросив надосадочную жидкость.
5. Ресуспендируйте обработанные иономицином и необработанные гранулы эритроцитарных клеток в 1 мл 1x связывающего буфера.
6. Разведите 2 мл 5x связывающего буфера аннексина V в 8 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) для получения 1x связывающего буфера.
7. Возьмите 235 мкл клеточных суспензий в связывающем буфере и добавьте 15 мкл конъюгата Аннексин V-Alexa Flour 488.
8. Инкубируйте клетки при комнатной температуре (ОТ) в течение 20 минут в темном месте. Центрифугируйте при 700 x g в течение 5 мин при RT и удалите надосадочную жидкость.
9. Промойте клетки 2x связывающим буфером, суспендируя клеточную гранулу в 1,5 мл связывающего буфера, центрифугируя при 700 x g в течение 5 минут при RT и удалив надосадочную жидкость.
10. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 250 мкл 1x связывающего буфера для измерений проточной цитометрии.

2. Проточная цитометрия

1. Перенесите 200 мкл эритроцитов, окрашенных аннексином V, в 1 мл полистирольных пробирок с круглым дном, совместимых с проточной цитометрией.
2. Войдите в программное обеспечение проточной цитометрии и нажмите на кнопку нового эксперимента. Нажмите на кнопку новой трубки. Выберите глобальный лист и выберите применить анализ для измерения интенсивности флуоресценции с длиной волны возбуждения 488 нм и длиной волны излучения 530 нм.
3. Установите количество клеток равным 20 000, которые будут собраны для анализа сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS).
4. Выберите нужную трубку и нажмите на кнопку загрузки. Нажмите кнопку записи для измерения прямого и бокового рассеяния. Повторите для всех образцов.
5. Щелкните правой кнопкой мыши по кнопке образца и нажмите «Применить пакетный анализ», чтобы создать файл результатов.
6. Щелкните правой кнопкой мыши по кнопке образца и выберите «Создать файлы FSC».

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аннексин V Alexa Fluor 488 - набор для апоптоза	Научный центр Фишера	А10788	Хранить при температуре 4 °C
Проточный цитометр BD FACSAria II	BD Biosciences	643177
Иономицин кальциевая соль	EMD Milipore Corp.	407952-1МГ	Растворите в ДМСО до 2 мМ. Хранить при температуре -20 °C
центрифуга	Миллипора Сигма	М7157	Модель Eppendorf 5415C
Одноразовая пробирка для проточной цитометрии с круглым дном	ВВР	VWRU47729-566
CaCl2	Научный центр Фишера	С79-500
ДПБС	VWR Медико-биологические науки	SH30028.02
Микроцентрифужная пробирка	Научный центр Фишера	Тел.: 02-681-5
Цельная кровь при АХД	Дзен-Био		Перед использованием хранить при температуре 4 °C и нагреть до 37 °C