$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве удобной точки отсчета для читателей, следующая методология описывает конкретные условия культивирования и материалы, необходимые для измерения биодоступности Fe из 20 экспериментальных образцов, плюс требуемый контроль качества, в ходе биопробы. Увеличение количества образцов сверх этой емкости не рекомендуется из-за времени, необходимого для различных этапов клеточной культуры и экстракорпорального расщепления в рамках биопробы.
1. Выбор количества образцов
- Для твердых или жидких пищевых продуктов определите количество пищи, которое можно считать репрезентативным для тестируемого образца.
- При тестировании на биодоступность Fe из сорта фасоли используйте 100-150 г семян фасоли и обработайте это количество до однородного образца.
- Для жидких проб, таких как обогащенные соки, молочные продукты и спортивные напитки, убедитесь, что пища хорошо перемешана перед отбором проб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество материала семян фасоли, упомянутое выше, имеет важное значение для объяснения внутренних различий между семенами этой основной культуры.
2. Подготовка образцов
- Перед обработкой смойте почву и пыль с любого образца пищевых продуктов дистиллированно-деионизированной водой.
- Обработайте соответствующее количество образца в соответствии с целями эксперимента, например, методом варки и измельчения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления пищи и обработки крайне важно использовать посуду и оборудование, которые не являются потенциальным источником загрязняющих веществ Fe. Оборудование из нержавеющей стали не загрязняет окружающую среду; однако такое оборудование, как мельницы для каменных мельниц, чугунная посуда и любое оборудование, не содержащее железо, может добавить значительное количество загрязняющего вещества. Для помола часто достаточно стандартной кофемолки из нержавеющей стали.
- Лиофилизируйте и измельчите до однородного порошка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исследования показали, что после гомогенизации для каждого измеряемого продукта достаточно трех независимых повторений анализа.
- Если однородность образца трудно достичь, пересмотрите рецептуру или обработку продукта. Если это невозможно, добавьте репликации, если неоднородность не является серьезной.
- Для большинства однородных твердых продуктов используйте 0,5 г лиофилизированного образца на одну реплику. При необходимости используйте до 1,0 г образца на одну реплику, но проверьте, дает ли более 0,5 г пользу в степени реакции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации более 0,5 г твердой пищи могут закупорить диализную мембрану (см. ниже).
- Используйте 1-2 мл жидких образцов.
заметка: Лиофилизация часто не требуется для жидких образцов.
3. Культура клеток Caco-2
- Шток-культуры
- Приобретайте элементы Caco-2 у сертифицированного поставщика.
- Культивируйте клетки из исходных флаконов при 37 °C в инкубаторе с 5% атмосферойCO2 (постоянная влажность) с использованием модифицированной орлиной среды (DMEM) от Dulbecco с добавлением 25 мМ HEPES (pH 7,2), 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антимикотического раствора антибиотика.
- Как только будет получено достаточное количество клеток, обычно через 7-10 дней культивирования, засейте клетки в колбы, не покрытые коллагеном, с плотностью 30 000 клеток/см2.
- Выбирайте размер колбы в зависимости от количества доступных ячеек и необходимых для посева многолуночных пластин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, колбы T225 (225 см2) лучше всего подходят для экспериментов, в которых используются 11 многолуночных (6-луночных; 9,66 см2/луночных) планшетов (10 планшетов для сравнения образцов, 1 планшет для контроля качества) на биоанализ .
- Выращивайте клетки в колбах в течение 7 дней, меняя среду через день, и используйте на 7-й день для посева многолуночных пластин.
Примечание: Рекомендуется использовать диапазон прохода не более 10-15 пассажей с момента начала производства клеток из исходной культуры и последующего использования в серии экспериментов. Пассажи клеточных культур должны быть ограничены, так как широкий диапазон пассажей может привести к адаптивным изменениям в клеточной линии и, таким образом, к вариабельности реакции модели.
- Культивирование клеток на многолуночных планшетах
- Засейте клетки Caco-2 с плотностью 50 000 клеток/см2 в 6-луночных планшетах, покрытых коллагеном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг обычно работает лучше всего, если делать его в среду. Следующие шаги позволят понять, почему именно этот день недели является оптимальным.
- Выращивайте клетки в течение 12 дней при 37 °C в инкубаторе с 5% атмосферойCO2 (постоянная влажность) с использованием DMEM с добавлением 25 мМ HEPES (pH 7,2), 10% (v/v) FBS и 1% раствора антибиотика-антимикотика><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование клеточных монослоев дольше 12 дней может привести к чрезмерному росту клеток. Предыдущие исследования ясно показали, что в этих условиях, через 12 дней после посева, монослой клеток является зрелым, хорошо прикрепляется к пластине и оптимален по консистенции ответа. Более длительный рост клеток, например, до 19-21 дня, приводит к чрезмерному росту клеток, а среда быстро истощается питательными веществами, что приводит к образованию нездоровых монослоев.
- В течение 12-дневного периода меняйте среду не реже одного раза в 2 дня по постоянному ежедневному графику.
- На12-й день после посева замените питательную среду 2 мл минимально незаменимой среды (MEM [pH 7]) с добавлением 10 мл PIPES (пиперазин-N,N'-бис-[2-этансульфоновая кислота]), 1% раствор антибиотика-антимикотика, гидрокортизон (4 мг/л), инсулин (5 мг/л), селен (5 мкг/л), трийодтиронин (34 мкг/л) и эпидермальный фактор роста (20 мкг/л).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если посев был начат в среду, то 12-й день будет понедельником.
- На следующий день (т.е. на 13-й день) извлеките MEM и замените его 1 мл MEM (pH 7).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг будет выполнен во вторник. Именно в этот день начинается биопроба; Таким образом, 13-дневный график дает преимущество последовательного недельного графика, что позволяет проводить биоанализ последовательно в один и тот же день недели.
4. Экстракорпоральное переваривание
- Подготовка вставных колец
- Создайте стерилизованное вставное кольцо с помощью силиконового уплотнительного кольца, оснащенного диализной мембраной, промытой кислотой (рис. 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте вкладыши за 1 день (т.е. в понедельник, день 12) дня проведения биоанализа и храните в воде с температурой 18 МОм при температуре 4 °C до готовности к использованию.
- В день проведения биоанализа (вторник, день 13) достаньте вкладыши из холодильника, слейте воду и замените воду на 0,5 М HCl. Оставьте при комнатной температуре в вытяжке с ламинарным потоком не менее чем на 1 час перед использование><м.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует выполнить до извлечения МЕМ из культивальных планшетов. Кислотная промывка мембраны служит для удаления возможного загрязнения Fe и стерилизует вставное кольцо и мембрану.
- Слейте 0,5 М HCl со вкладышей и промойте стерильной водой 18 МОм. Хранить в стерильной воде 18 МОм при комнатной температуре в вытяжке с ламинарным потоком до готовности к использованию.
- Вставьте кольцо в каждую лунку из 6-луночных планшетов с ячейками Caco-2, тем самым создав двухкамерную систему. Верните тарелки с вкладышами в инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует выполнять сразу после добавления свежих 1,0 мл МЭМ в каждую лунку (см. Шаг 3.2.5.).
- Приготовление раствора пепсина
- В день эксперимента приготовьте раствор пепсина, растворив 0,145 г пепсина в 50 мл 0,1 М HCl. Осторожно встряхните раствор на платформе-шейкере в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Приготовление панкреатин-желчного раствора
- В тот же день, что и эксперимент, приготовьте 0,1 М NaHCO3, растворив 2,1 г NaHCO3 в 250 мл 18 МОм воды.
- Смешайте 0,35 г панкреатина и 2,1 г желчного экстракта в 175 мл 0,1 М NaHCO3.
- После того, как панкреатин и желчный экстракт растворятся, добавьте 87,5 г слабой катионобменной смолы (см. Таблицу материалов) и перемешайте, встряхивая в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Вылейте кашицу в большую колонну и соберите элюат.
- Разбавьте колонку еще 70 мл 0,1 М NaHCO3, собрав этот объем в раствор желчи панкреатина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью смолы является удаление загрязняющего вещества Fe, обычно встречающегося в экстрактах панкреатина и желчи.
- Инициируйте экстракорпоральное переваривание.
- Образец взвесить в стерильной центрифужной пробирке объемом 50 мл (полипропилен) с последующим добавлением 10 мл физиологического раствора при pH 2, содержащего 140 мМ NaCl и 5 мМ KCl.
- Начните процесс желудочного пищеварения, добавив в образец 0,5 мл приготовленного раствора свиного пепсина, и инкубируйте в качающемся шейкере при низкой щадящей температуре в течение 1 ч при 37 °C.
- По истечении этого периода запустите процесс кишечного переваривания каждого образца, регулируя pH до 5,5-6,0 с 1,0 М NaHCO3.
- Добавьте 2,5 мл раствора панкреатина-желчи в каждую пробирку с образцом и отрегулируйте pH до 6,9-7,0 с помощью 1,0 М NaHCO3.
- После регулировки pH выровняйте объем в каждой пробирке с помощью 140 мМ раствора NaCl, 5 мМ KCl (pH 6,7), измерив вес пробирки с целевым значением 15 г.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Для некоторых продуктов может потребоваться довести общий объем до 16 г или 17 г, в зависимости от буферной способности продуктов.
- Перенесите по 1,5 мл каждого кишечного расщепления в верхнюю камеру (т.е. содержащую вставное кольцо с диализной мембраной) соответствующей лунки 6-луночного культурального планшета, содержащего клетки Caco-2 (рис. 1B).
- Установите на место крышку планшета и инкубируйте при температуре 37 °C (5%CO2 атмосферы) на качающемся вибростенде со скоростью 6 колебаний/мин в течение 2 часов.
- Снимите вставное кольцо с варваром и добавьте дополнительно по 1 мл MEM (pH 7) в каждую лунку.
- Верните планшет для культивирования клеток в инкубатор (37 °C; 5%CO2 в атмосфере) еще на 22 часа.
- Через 22 ч удалить среду для культивирования клеток и добавить 2,0 мл 18 МОм воды в монослой клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вода будет осмотически лизовать клетки.
- Соберите весь лизат клеток в стандартные полипропиленовые микроцентрифужные пробирки или аналогичные для последующего анализа клеточного белка и клеточного ферритина.
