$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны выполняться в шкафу биобезопасности класса II с включенной воздуходувкой и выключенным светом.
1. Подготовка материалов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы перечислены в таблице материалов.
- Приготовьте среду 1, центрифугирующую среду 2, а также растворы для хранения и обработки флуоресцентных 2-дезокси-2-[(7-нитро-2,1,3-бензоксадиазол-4-ил) амино]-D-глюкозы (2-NBDG или FD-глюкозы) в соответствии с таблицей 1 в шкафу биобезопасности класса II. Защищайте FD-глюкозу от света на протяжении всего эксперимента, выключив весь свет под капотом.
- Используйте готовые к применению реагенты для клеточных культур: трипсин-ЭДТА, фосфатно-солевой буфер (PBS) и модифицированную орлиную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium без глюкозы и фенола (далее — безглюкозная DMEM).
- Используйте 20 мл буфера для лизиса радиоиммунопреципитации (RIPA).
ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих разделах сравнивается внеклеточное истощение и внутриклеточное поглощение различных доз FD-глюкозы в фибробластах 3T3-L1 со стимуляцией инсулином и без нее (Рисунок 1).
2. Культивирование и поддержание клеток 3T3-L1
- Культивирование мышиных фибробластов 3T3-L1 путем гальванического покрытия 1 х 106 клеток, разведенных в 20 мл среды 1 в двух 96-луночных планшетах. Тарелку 100 мкл клеточной суспензии на лунку, обеспечивая поддержание однородности этой суспензии путем перемешивания. Выращивайте клетки в течение 48 ч в инкубаторе при температуре 37 °C (5%CO2 и 95% влажности) без смены среды до примерно 70%-80% конфлюенции.
- Поддерживайте слияние клеток натощак, культивируя их в одной и той же среде в течение 48 ч. Варьируйте время инкубации от 24 до 72 ч в зависимости от желаемого катаболического состояния натощак.
3. Голодание клеток 3T3-L1
- Сцеживайте среды из ячеек в 96-луночных планшетах. Впитайте оставшуюся жидкость с помощью стерильных бумажных полотенец.
- Промойте планшет на 96 лунок 100 μл PBS на лунку и впитайте оставшуюся жидкость стерильными бумажными полотенцами.
- Добавьте 100 μл безглюкозного DMEM на лунку и инкубируйте в течение 40 мин. Регулируйте время инкубации в зависимости от типа клеток, стимулов и желаемого уровня натощак.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может потребовать оптимизации в зависимости от сезона.
4. Приготовление растворов FD-глюкозы с различной концентрацией
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент на рисунке 1 исследует внеклеточные и межклеточные среды со стимуляцией инсулином и без нее.
- Используйте восемь повторов (один ряд в 96-луночном планшете) для каждого условия стимуляции. Поэтому приготовьте 1 мл для каждого условия стимуляции (указано в таблице 2 и ниже).
- Используйте восемь условий стимуляции без инсулина: FD-глюкоза 2,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05 мкг/мл и 0 мкг/мл (контроль без FD-глюкозы) в одном 96-луночном планшете.
- Используйте восемь условий стимуляции инсулином (10 мкг/мл, конечная концентрация): FD-глюкоза 2,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,05 мкг/мл и 0 мкг/мл (контроль без FD-глюкозы) в другом 96-луночном планшете.
- Для приготовления условий стимуляции разведите 1 мкл рабочего раствора FD-глюкозы 5 мг/мл (табл. 1) в 999 мкл безглюкозного DMEM с получением 1 мл раствора рабочего состава (разведение 1:1000 или 5 мкг/мл).
- Используя этот раствор рабочего состава, приготовьте 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:250000, 1:50000 и 1:100000 FD-глюкозы для получения 2,5 г/мл, 1 г/мл, 0,5 мкг/мл, 0,2 г/мл, 0,1 мкг/мл и 0,05 мкг/мл (табл. 2) в пробирках объемом 2 мл непосредственно перед экспериментами в биобезопасном шкафу без света.
- Повторите шаг 4.4 и добавьте по 1 мкл инсулина (10 мг/мл, конечная концентрация) в каждое из указанных выше условий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация инсулина в этих образцах составляет 10 мкг/мл = 1,7 нмоль/мл. Чтобы добиться гомогенизации, добавьте инсулин в трубки перед добавлением других растворов.
5. Лечение голодающих клеток 3T3-L1
- Через 40 минут инкубации сцедите безглюкозный DMEM из каждой лунки в 96-луночные планшеты и всасывайте оставшуюся жидкость стерильными бумажными полотенцами.
- Добавьте по 100 мкл (на лунку) из различных условий обработки, описанных выше, в лунки вдоль одной колонны и 100 мкл (на лунку) из тех же условий обработки в лунки вдоль ряда (восемь повторов) в обеих 96-луночных пластинах. Пометьте пластины, на которых использовались условия с инсулином и без него. Добавьте в контрольные лунки только ДМЭМ, не содержащую глюкозы (n = 8).
- Инкубируйте планшет в течение 40 минут в инкубаторе для клеточных культур (37 °C, 5%CO2 и 95% влажности) в темноте.
6. Внеклеточные и межклеточные измерения для стимулированных клеток 3T3-L1
- После стимуляции клеток в течение 40 минут перенесите стимулирующую среду с обоих планшетов на новые 96-луночные планшеты, сохраняя ту же экспериментальную схему.
- Сцедите любой оставшийся раствор из оригинального стимулированного 96-луночного планшета с ячейками на стерильные бумажные полотенца.
- По желанию можно промыть камеры с помощью PBS. Удалите PBS и сцедите оставшийся раствор на стерильные бумажные полотенца.
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл буфера для лизиса RIPA. По желанию добавьте ингибитор протеазы в буфер RIPA для защиты белков. Поместите тарелки с RIPA в шейкер на 30 минут.
- С помощью считывателя микропланшетов (Table of Materials) измерьте флуоресценцию на длинах волн возбуждения (Ex) и излучения (Em) 485 и 535 нм соответственно, сначала в среде, содержащей внеклеточную FD-глюкозу, а затем в планшете с RIPA-лизированными клетками в конце 30-минутной инкубации (см. шаг 6.4).
Таблица 1: Приготовление питательных сред и растворов FD-глюкозы.
| Решение/Среда | Компоненты |
| Этанол:ДМСО (1:1/v/v) | Этанол (200 мкл) и ДМСО (200 мкл) в пробирке объемом 1-1,5 мкл; использовать этанол клеточной культуры и ДМСО |
| Средний 1 | DMEM (89 мл), пенициллин/стрептомицин (1%) (1 мл) и сыворотка теленка (10%) (10 мл) в стерильной пробирке объемом 50 мл |
| Центрифугирующая среда 2 | DMEM (89 мл), пенициллин/стрептомицин (1%) (1 мл) и сыворотка крупного рогатого скота (10%) (10 мл) в стерильной пробирке объемом 50 мл |
| Хранение раствора FD-глюкозы 5 мг/мл (14,5 мМ) | FD глюкоза (1 мг) и этанол:ДМСО (1:1/v/v) (200 μл) в пробирке объемом 0,5 мл; хранить при -80 °C, преимущественно в атмосфере аргона или азота |
| Рабочий раствор FD-глюкозы 5 мкг/мл (14,5 мМ) | Хранение FD раствор глюкозы 5 мг/мл (1 μл), свободный от глюкозы DMEM (999 μл); готовьте непосредственно перед экспериментом. |
Таблица 2: Приготовление растворов FD-глюкозы с различными концентрациями для экспериментов, показанных на рисунке 1.
г.
| разбавление | контроль | 1:2x103 | 1:5х103 | 1:1х104 | 1:2.5x104 | 1:5х104 | 1:1x105 |
| Концентрация (мкг/мл) | 0 | 2.5 | 1 | 0,5 | 0,2 | 0,1 | 0,05 |
| Безглюкозный DMEM (μл) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD глюкоза 5 мкг/мл (μл) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
