Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны выполняться в шкафу биобезопасности класса II с включенной воздуходувкой и выключенным светом.
1. Подготовка материалов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы перечислены в таблице материалов.
- Приготовьте среду 1, центрифугирующую среду 2, а также растворы для хранения и обработки флуоресцентных 2-дезокси-2-[(7-нитро-2,1,3-бензоксадиазол-4-ил) амино]-D-глюкозы (2-NBDG или FD-глюкозы) в соответствии с таблицей 1 в шкафу биобезопасности класса II. Защищайте FD-глюкозу от света на протяжении всего эксперимента, выключив весь свет под капотом.
- Используйте готовые к применению реагенты для клеточных культур: трипсин-ЭДТА, фосфатно-солевой буфер (PBS) и модифицированную орлиную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium без глюкозы и фенола (далее — безглюкозная DMEM).
2. Ex vivo измерение внеклеточного истощения FD-глюкозы в органах
- Перед вскрытием органа мышей предварительно обрабатывают соединениями, стимулирующими метаболизм глюкозы, следующим образом.
- Используйте девятинедельных мышей-самцов Lepob (n = 11). Перед экспериментом накормите всех мышей обычной диетой чау
.
- Случайным образом разделите мышей на три группы для внутрибрюшинных инъекций.
- Мышам из контрольной группы Lepob вводили 0,1 мл стерильного PBS (n = 4).
- Мышам из группы инсулина Lepob вводили 0,1 мл стерильного PBS, содержащего 12 МЕ человеческого инсулина на грамм массы тела (МТ) (n=3).
- Мышам из группы AAC2 Lepob вводили 0,1 мл стерильного PBS, содержащего 0,1 нмоль AAC2 на грамм массы тела (МТ) (n = 4).
- Через 15 мин мышей подвергают вдыханию 5% изофлурана и обескровливанию крови путем пункции сердца у животных, находящихся под наркозом.
- Препарируйте висцеральную эпидидимальную белую жировую ткань (200 мг), печень (200 мг) и весь мозг каждого животного. Используйте колпак биобезопасности класса II для работы с тканями.
- Приготовьте рабочий раствор FD-глюкозы (0,29 мМ) в безглюкозном DMEM в шкафу биобезопасности класса II без освещения.
- Измерьте флуоресценцию рабочего раствора FD-глюкозы (0,29 мМ) на длинах волн возбуждения и излучения 485 и 535 нм соответственно с помощью считывателя микропланшетов.
- Инкубируйте собранные ткани/органы в 6-луночном планшете, содержащем PBS, в течение 1 мин. Обрабатывайте каждую ткань или орган в отдельной лунке.
- Через 1 минуту положите каждую салфетку на стерильное бумажное полотенце, чтобы впитать PBS. Перенесите ткани/органы в отдельный 6-луночный планшет, содержащий 4 000 μл безглюкозного DMEM, и инкубируйте в течение 2 минут.
- Через 2 мин удалить и перенести ткани в лунки 6-луночного планшета, содержащего 0,29 мМ рабочего раствора FD-глюкозы (1 мл/лунка). Инкубируйте 6-луночные планшеты, содержащие ткани, в рабочем растворе FD-глюкозы при 37 °C (5%CO2 и 95% влажности).
- Соберите по 100 мкл рабочего раствора FD-глюкозы из каждой лунки после 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минут инкубации для анализа кинетики истощения внеклеточной глюкозы FD. Встряхните до и после сбора.
- Перенесите 100 мкл рабочего раствора FD-глюкозы в 96-луночные планшеты для измерения флуоресценции на длинах волн возбуждения и излучения 485 и 535 нм соответственно с помощью считывателя микропланшетов.
- Нормализуйте флуоресценцию до значения 0 мин (100%) для каждого органа у каждого животного (рис. 1).
Таблица 1: Приготовление питательных сред и растворов FD-глюкозы.
| Решение/Среда | Компоненты |
| Этанол:ДМСО (1:1/v/v) | Этанол (200 мкл) и ДМСО (200 мкл) в пробирке объемом 1-1,5 мкл; использовать этанол клеточной культуры и ДМСО |
| Средний 1 | DMEM (89 мл), пенициллин/стрептомицин (1%) (1 мл) и сыворотка теленка (10%) (10 мл) в стерильной пробирке объемом 50 мл |
| Центрифугирующая среда 2 | DMEM (89 мл), пенициллин/стрептомицин (1%) (1 мл) и сыворотка крупного рогатого скота (10%) (10 мл) в стерильной пробирке объемом 50 мл |
| Хранение раствора FD-глюкозы 5 мг/мл (14,5 мМ) | FD глюкоза (1 мг) и этанол:ДМСО (1:1/v/v) (200 μл) в пробирке объемом 0,5 мл; хранить при -80 °C, преимущественно в атмосфере аргона или азота |
| Рабочий раствор FD-глюкозы 5 мкг/мл (14,5 мМ) | Хранение FD раствор глюкозы 5 мг/мл (1 μл), свободный от глюкозы DMEM (999 μл); готовьте непосредственно перед экспериментом. |
