Методическая статья

Измерение сокращения SMC in vitro: неинвазивный метод оценки сокращения гладкомышечных клеток с использованием электрического измерения импеданса клетки-субстрата

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Богунович, Н. и др., Выделение первичных гладкомышечных клеток аорты, специфичных для пациента, и полуколичественные измерения сокращения в реальном времени in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

Это видео описывает измерение сокращения гладкомышечных клеток аорты (SMC) с помощью измерения электрического импеданса клетки-субстрата, или ECIS. ECIS измеряет локомоцию клеток и является надежным методом измерения сокращений.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными руководящими принципами по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом

1. Измерение сжатия (пример SMC)

  1. Подготовьте матрицу ECIS 96w10e (см. Рисунок 1A для репрезентативного изображения матрицы с увеличенными электродами и ячейками, засеянными на электроды).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги под колпаком для культуры стерильных тканей.
    1. Покройте стерильную матрицу 96w10e 200 мкл 10 мМ L-цистеина в лунку в течение 30 минут при комнатной температуре.
    2. Дважды промойте тарелку стерильной водой. Дайте планшету высохнуть в течение ночи в вытяжке для тканевых культур с приоткрытой крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие пластины L-цистеином необходимо только при первом использовании пластины.
    3. На следующий день простерилизуйте тарелку и крышку ультрафиолетовым излучением в течение 30 мин. Переверните крышку вверх, чтобы внутренняя часть была стерилизована. После стерилизации пластины не открывайте ее за пределами проточного колпака.
  2. Засеивание ячеек на массиве ECIS
    1. Подогреть 1% стерильный раствор желатина на водяной бане в течение 30 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор хранится в холодильнике и может застыть, что затруднит его пипетирование.
    2. Затем покройте лунки 100 мкл 1 % раствора желатина на лунку и инкубируйте планшет при 37 °C в течение не менее 1 ч.
    3. Отсадите желатин из лунок.
    4. Подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток и засейте SMC в трех экземплярах при плотности посева 30 000 клеток/лунку в 200 μл среды SMC.
    5. Поместите планшет с SMC в 96-луночный держатель ECIS в инкубаторе для клеточных культур. Дважды щелкните по программному обеспечению ECIS Applied Biophysics, чтобы открыть программу, и нажмите кнопку «Настройка».
    6. Проверьте, все ли электроды имеют контакт с держателем (зеленый; красный, если соединения нет) на левой нижней панели с надписью «Конфигурация лунки». Если электроды подключены неправильно, отрегулируйте пластину в держателе перед началом измерения.
    7. Выберите тип пластины (массив из 96 лунок) на той же панели, нажав кнопку Тип массива.
    8. В правой верхней панели Data Collection Setup нажмите на одну частоту и измените значение импеданса на 4000 Гц, а интервал на 8 с.
    9. Нажмите кнопку Старт, чтобы начать измерения. Дождитесь открытия новой панели, на которой можно сохранить файл ECIS.
    10. Дайте ячейкам прикрепиться и установите монослой на 48 л.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Прикрепление и распределение элементов на электродах генерирует базовое значение сопротивления (Рисунок 1B).
  3. Стимуляция клеток для индуцирования сокращения
    1. Индуцировать сокращение SMC путем стимуляции клеток 10 мкг/мл ионофора кальция, иономицина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иономицин индуцирует приток внеклеточного Ca2+, активируя сократительный каскад; см. Рисунок 2А для репрезентативных изображений нестимулированных и стимулированных сокращенных клеток.
    2. Разведите 1 мг порошка иономицина в 100 мкл диметилсульфоксида до получения исходного раствора 10 мг/мл и храните 10 мкл аликвот при -20 °C. Перед применением раствор иономицина следует развести в соотношении 1:10 в среде SMC для приготовления рабочего раствора, который будет добавлен в клетки.
    3. Выполняйте клеточную стимуляцию, пока матрица все еще находится в держателе матрицы внутри инкубатора для клеточных культур, а электроды прикреплены к системе.
      1. Чтобы стимулировать клетки, снимите крышку и поместите ее на стерильную поверхность внутри инкубатора. Подготовьте две пипетки, установленные на 2 мкл и 150 мкл.
      2. Перед началом стимуляции нажмите Mark в программе и оставьте комментарий.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это облегчит поиск точного времени стимуляции при анализе данных.
      3. Пипеткой внесите по 2 мкл рабочего раствора иономицина в каждую лунку как можно быстрее. После того, как все клетки будут стимулированы, перемешайте среду в лунках с помощью второй пипетки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за быстрого эффекта нет необходимости менять кончики между различными клеточными линиями и условиями. Работают быстро, стимулируя и перемешивая, потому что иономицин обладает острым действием. При стимуляции полной тарелки стимулируйте максимум 3 колонны одновременно. После каждой стимуляции подождите не менее 30 минут до следующей стимуляции, чтобы дать клеткам восстановиться после изменения температуры иCO2, вызванного открытием дверцы инкубатора.
      4. Сразу после завершения стимуляции нажмите Mark еще раз, чтобы добавить комментарий о том, что стимуляция завершена.
  4. Завершение эксперимента по стимуляции
    1. Запишите значения импеданса в течение примерно 5 минут после стимуляции иономицина. Завершите запись, нажав клавишу Finish.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Установка пластины ECIS и графическое представление сокращения SMC аорты. а) левый; 96-луночная пластина ECIS. Середина; увеличение одной лунки пластины ECIS, показывающее десять электродов на дне лунки. Правильно; изображение с помощью светового микроскопа SMC, засеянных на пластину ECIS; увеличение 10x. (B) Кривые сопротивления, измеренные с помощью ECIS...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Массив на 96 лунокПрикладная биофизика96W10idf ПЭТМассив, используемый для измерения сжатия в настройке ECIS
Сосудистые гладкомышечные клетки человека Базальная среда (ранее ''Medium 231'')GibcoM231500Среда, используемая для культивирования гладкомышечных клеток
ДиметилсульфоксидСигма-Олдрич472301Раствор, используемый для разбавления иономицина
Инвитроген графиня IIThermo Fisher ScientificAMQAX1000Автоматический счетчик ячеек
Иономицин кальциевая соль из Streptomyces conglobatusСигма-ОлдричИ0634-1МГСостав, используемый для стимуляции схваток
ZThetaПрикладная биофизикаZThetaПрибор ECIS, используемый для измерения сжатия

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ECISECIS Applied Biophysics

Похожие статьи