Анализ скользящих актиновых филаментов: анализ подвижности in vitro для изучения транслокации актиновых филаментов на иммобилизованных миозинах

Аннотация

Источник: Tripathi, A., et al. Миозин-специфические адаптации анализов подвижности на основе флуоресцентной микроскопии in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео мы проводим анализ моторики in vitro для анализа взаимодействий актина и миозина. Скользящее движение актиновых филаментов на иммобилизованных молекулах миозина визуализируется с помощью флуоресцентной микроскопии.

Протокол

1. Скользящий анализ актиновых филаментов

1. Подготовка покровного стекла
   1. Сделайте 1% раствор нитроцеллюлозы в амилацетате.
   2. Возьмите чашку для культуры тканей (150 x 25 мм) и добавьте на дно чашки круглую фильтровальную бумагу (диаметром 125 мм).
   3. Загрузите на решетку восемь квадратных покровных стекол No 1,5 толщиной 22 мм и промойте их примерно 2-5 мл этанола 200-й крепости, а затем 2-5 мл дистиллированной воды (dH₂O). Повторите этот этап промывки, закончив водой. Затем полностью высушите покровные стекла с помощью линии фильтрованного воздуха или N_2-line.
   4. Возьмите одну защитную пленку и медленно нанесите пипеткой 10 μл 1% раствора нитроцеллюлозы по одному краю покровного стекла. Затем одним плавным движением размажьте его по остальной части покровного стекла с помощью наконечника для пипетки объемом 200 мкл с гладкой стороной. Поместите эту защитную пленку на чашку для культуры тканей нитроцеллюлозной стороной вверх. Повторите то же самое для оставшихся покровных стекол и дайте им высохнуть, пока готовятся оставшиеся реагенты, и используйте покровные стекла в течение 24 часов после нанесения покрытия.
2. Подготовка камеры
   1. Протрите предметное стекло микроскопа оптической бумагой для линз, чтобы очистить его от крупного мусора. Отрежьте два куска двустороннего скотча, примерно 2 см в длину.
   2. Поместите одну деталь вдоль середины длинного края предметного стекла микроскопа. Убедитесь, что край ленты совпал с краем предметного стекла. Поместите второй кусок ленты примерно на 2 мм ниже первого куска ленты так, чтобы они были параллельны и выровнены. В результате создается проточная камера, которая может вмещать около 10 μл раствора (см. рис. 1).
   3. Возьмите одну из покровных стекол с нитроцеллюлозным покрытием из части 1. Осторожно наклейте покровное стекло на ленту таким образом, чтобы сторона, покрытая нитроцеллюлозой, непосредственно соприкасалась с лентой (см. рисунок 1). С помощью наконечника для дозатора осторожно надавите на интерфейс ползунка-ленты, чтобы убедиться, что покровное стекло правильно приклеено к предметному стеклу. Срежьте лезвием бритвы лишнюю ленту, свисающую с края горки.
3. Приготовление актина
   1. Получите 20 мкМ F-актин путем полимеризации глобулярного актина (G-актина) в полимеризационном буфере (50 мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT, 25 мМ MOPS (pH 7,0) при 4 °C в течение ночи.
   2. Развести F-актин до 5 мкМ в буфере для подвижности (20 мМ MOPS, 5 мМ MgCl₂, 0,1 мМ EGTA, 1 мМ DTT (pH 7,4)). Метка содержит не менее 1,2-кратного молярного избытка родамина-фаллоидина. Оставьте (накрытый алюминиевой фольгой) не менее чем на 2 часа на льду. Его можно использовать до 1-2 месяцев, а хранить на льду.
4. Проведение анализа миозина 5a скользящей актиновой нити
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе представлены детали скользящего анализа миозина 5a (HMM).
   1. Приготовьте растворы миозина 5а, описанные в таблице 1, и держите их на льду.
   2. Влейте 10 мкл миозина 5а (50-100 нМ) через проточную камеру и подождите 1 минуту.
   3. Расход в 10 мкл 1 мг/мл БСА в 50 мМ МБ с 1 мМ DTT (буфер с низким содержанием соли). Повторите эту стирку еще два раза и подождите 1 минуту после третьей стирки. Используйте уголок папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы пропустить раствор через канал, аккуратно поместив уголок бумаги на выходе из проточной камеры.
   4. Умойтесь 10 μL или 50 мМ MB с 1 mM DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
   5. Влейте 10 мкл раствора черного актина (5 мкМ F-актина, 1 мкМ кальмодулина и 1 мМ АТФ в 50 мМ МБ с 1 мМ DTT) для устранения «мертвых голов».
      1. Пипеткой нагнетайте раствор с помощью шприца объемом 1 мл и иглы 27 G, чтобы срезать актиновые нити, прежде чем вводить раствор в камеру. Повторите этот шаг еще два раза и подождите 1 минуту после третьего раза. Достаточно примерно 20 операций пипетирования.
      2. Чтобы выполнить вращение «мертвой головы», добавьте стехиометрическое количество F-актина к миозину в присутствии 1 мМ АТФ и 1 мМ MgCl2 при концентрации соли 500 мМ. Затем ультрацентрифугу при 480 000 x g в течение 15 мин при 4 °C. Мертвый миозин будет находиться в грануле.
   6. Расход в 50 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT и 1 мМ АТФ для истощения камеры свободных актиновых филаментов.
   7. Умойтесь 10 μL или 50 мМ MB с 1 mM DTT. Повторите эту промывку еще два раза, чтобы истощить в камере любой АТФ.
   8. Влейте 10 мкл 20 нМ раствора родамина актина (Rh-Actin), содержащего 1 мМ DTT в 50 мМ MB, и подождите 1 мин, чтобы обеспечить строгое связывание актиновых филаментов с миозином 5a, прикрепленным к поверхности покровного стекла.
   9. Промойте 10 мкл 50 мМ MB с 1 мМ DTT, чтобы смыть нити Rh-актина, не связанные с поверхностью. Повторите эту стирку еще два раза.
   10. Влейте 30 мкл конечного буфера.
   11. Записывайте изображения на флуоресцентный микроскоп с использованием волны возбуждения 561 нм для визуализации резус-актина. Подходящее время экспозиции составляет 200 мс при мощности лазера 1,4 мВт при общей продолжительности регистрации 0,5-1 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что скорость захвата масштабирована в соответствии со скоростью движущихся нитей. Важным фактором перед сбором данных для использования с программами слежения является частота кадров при сборе данных. Субпиксельные перемещения между кадрами приведут к завышению скорости, а для получения точных значений требуются движения в несколько сотен нанометров. Оптимальная скорость захвата включает в себя скольжение актина на расстоянии не менее одного пикселя между кадрами. В случае микроскопа TIRF, используемого для получения изображений, этот порог составляет 130 нм; Таким образом, миозин, который, как ожидается, будет перемещаться со скоростью 1 мкм/с, должен быть визуализирован со скоростью 5 кадров/с (интервал 0,2 с) для достижения скорости движения 200 нм, в то время как миозин, который должен перемещаться со скоростью 10 нм/с, должен иметь скорость 0,05 кадра/с (интервал 20 с). Таким образом, при необходимости данные могут быть уменьшены на этом этапе.

Таблица 1: Буферы, используемые в скользящем анализе

Имя буфера	Композиция (M5a)	Состав (NM2b)	Используемые шаги (M5a/NM2b)	Комментарии
4X Буфер подвижности (4X MB)	80 мМ MOPS, pH 7,2	80 мМ MOPS, pH 7,2		Вакуумный фильтр и хранение при 4°C
	20 мМ MgCl2	20 мМ MgCl2
	0,4 мМ EGTA	0,4 мМ EGTA
	рН 7,4	рН 7,4
>50 мМ Буфер подвижности соли (50 мМ МБ)	25% по сравнению с 4X MB	25% по сравнению с 4X MB		Вакуумный фильтр и хранение при температуре 4°C
	50 мМ KCl	50 мМ NaCl
	Увеличение громкости с помощью dH2O	Увеличение громкости с помощью dH2O
>500 мМ Буфер подвижности соли (500 мМ МБ)	Н/Д	25% по сравнению с 4X MB		Вакуумный фильтр и хранение при температуре 4°C
		500 мМ NaCl
		Увеличение громкости с помощью dH2O
Миозин	0,05-0,1 мкМ миозин	0,2 мкМ миозин	4.2	Оставайтесь на льду.
	1 мМ DTT	1 мМ DTT
	Разведение в 50 мМ МБ	Развести в 500 мМ МБ
1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА)	1 мг/мл БСА	1 мг/мл БСА	4.3	Оставайтесь на льду.
	Разведение в 50 мМ МБ	Развести в 500 мМ МБ
	1 мМ DTT	1 мМ DTT
5 μM Немеченый F-актин в 50 мМ МБ (черный актин)	5 мкМ немеченый F-актин	5 мкМ немеченый F-актин	4.5	Оставайтесь на льду. Сдвигать актин путем пипетирования вверх и вниз 5-10 раз или с помощью шприца.
	1 мкМ кальмодулин (CaM)	1 мМ АТФ
	1 мМ АТФ	0,2 мМ CaCl2
	Разведение в 50 мМ МБ	1 мкМ CaM
		1–10 нМ миозинкиназа легкой цепи (MLCK)
		Разведение в 50 мМ МБ
МБ с 1 мМ DTT и 1 мМ ATP	1 мМ DTT	1 мМ DTT	4.6	Оставайтесь на льду.
	1 мМ АТФ	1 мМ АТФ
	Разведение в 50 мМ МБ	Разведение в 50 мМ МБ
MB с DTT	1 мМ DTT	1 мМ DTT	4.4, 4.7, 4.9	Оставайтесь на льду.
	Разведение в 50 мМ МБ	Разведение в 50 мМ МБ
20 нМ Родамин-фаллоидин F-актин (Rh-актин)	20 нМ Родамин-фаллоидин F-актин	20 нМ Родамин-фаллоидин F-актин	4.8	Оставайтесь на льду. Не делайте вихрей.
	1 мМ DTT	1 мМ DTT
	Разведение в 50 мМ МБ	Разведение в 50 мМ МБ
Последний буфер	50 мМ KCl	0,7% метилцеллюлозы (по желанию)	4.10	Добавьте глюкозу, глюкозооксидазу и каталазу непосредственно перед проведением эксперимента. Держите на льду.
	20 мМ MOPS, pH 7,2	50 мМ NaCl
	5 мМ MgCl2	20 мМ MOPS, pH 7,2
	0,1 мМ EGTA	5 мМ MgCl2
	1 мМ АТФ	0,1 мМ EGTA
	50 мМ DTT	1 мМ АТФ
	1 мкМ кальмодулин	50 мМ DTT
	2,5 мг/мл глюкозы	1–10 нМ MLCK
	100 мкг/мл глюкозооксидазы	0,2 мМ CaCl2
	40 мкг/мл каталазы	1 мкМ кальмодулин
		2,5 мг/мл глюкозы
		100 мкг/мл глюкозооксидазы
		40 мкг/мл каталазы

Результаты

Рисунок 1: Подготовка функционализированных проточных камер. (А) Начните с очищенного предметного стекла микроскопа, двух кусков двустороннего скотча, обрезанных примерно до 2 см, и функционализированного покровного стекла. (B) Добавьте ленту в центр предметного стекла микроскопа. (C) Прикрепите покровное стекло к ленте покрытием (т.е. нитроцеллюлозо...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
амилацетат	Лэдд Рисерч Индастриз	10825
СПС	Миллипора Сигма	А7699
Бычий сывороточный альбумин	Миллипора Сигма	5470
Кальмодулин		PMID: 2985564
Каталазы	Миллипора Сигма	С40
Круглая фильтровальная бумага - скользящий анализ	Миллипора Сигма	WHA1001125
Стеллаж Coverslip	Миллипора Сигма	Z688568-1 шт.
Покровные стекла: Анализ нитей скользящего действия	VWR Интернэшнл	48366-227
DL-дитиотреитол	Миллипора Сигма	Д0632
Двусторонний скотч	Офисное депо	909955
ЭГТА	Миллипора Сигма	Е4378
этанол	Научный Фишер	А4094
G-актин		PMID: 4254541	Запас G-актина может храниться при концентрации 200 мкМ в жидкости N2.
глюкоза	Миллипора Сигма	Г8270
Глюкозооксидаза	Миллипора Сигма	Г2133
KCl	Научный Фишер	П217-500
Наконечники пипеток с большими отверстиями	Научный Фишер	02-707-134 (Английский
Метилцеллюлоза	Миллипора Сигма	М0512
Предметные стекла для микроскопа	Научный Фишер	12-553-10
Швабры	Научный Фишер	БП308-100
нитроцеллюлоза	Лэдд Рисерч Индастриз	10800
Лезвия	Офисное депо	397492
Родамин-фаллоидин	ThermoFisher Scientific	Р415	Исходный материал может быть разбавлен в 100% метаноле до конечной концентрации 200 мкМ.
Чашка для культивирования тканей - скользящий анализ	Корнинг	353025	Каждая чашка для культуры тканей может вместить примерно девять покровных стекол.
Наконечники для пипеток с гладкими стенками объемом 200 мкл	Томас Сайенти	1158У38
оборудование
центрифуга	ThermoFisher Scientific	75006590
микроскоп	Компания Nikon	Модель: Eclipse Ti с системой H-TIRF со 100-кратным объективом TIRF (N.A. 1.49)
Камера для микроскопа	Андор	Модель: камера iXon DU888 EMCCD (формат сенсора 1024 x 1024)
Коробка контроля окружающей среды для микроскопа	Токай ХИТ	Термобокс на заказ
Лазерный блок для микроскопа	Компания Nikon	LU-n4 четырехлазерный блок с твердотельными лазерами для 405 нм, 488 нм, 561 нм и 640 нм
Настольная ультрацентрифуга Optima Max-XP	Бекман Коултер	393315

)