Анализ инвертированной моторики: метод in vitro для визуализации движения миозина на иммобилизованных актиновых филаментах

Аннотация

Источник: Tripathi, A., et al. Миозин-специфические адаптации анализов подвижности на основе флуоресцентной микроскопии in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео мы проводим анализ моторики in vitro для анализа взаимодействий актина и миозина. Скользящее движение актиновых филаментов на иммобилизованных молекулах миозина визуализируется с помощью флуоресцентной микроскопии.

Протокол

1. Очистка белка

1. Лизис клеток и экстракция белка
   1. Подготовьте буфер экстракции в 1,5x на основе таблицы 1. Отфильтровать и хранить при температуре 4 °C.
   2. Начните размораживание клеточных гранул на льду. Пока гранулы оттаивают, добавьте в 100 мл экстракционного буфера 1,2 мМ дитиотреитола (DTT), 5 мкг/мл лейпептина, 0,5 мкМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и две таблетки ингибитора протеазы. Держите на льду.
   3. Как только гранула оттает, добавьте 1 мл добавленного экстракционного буфера на 10 мл клеточной культуры. Например, если клеточные гранулы были образованы из 500 мл клеточной культуры, то добавьте в гранулу 50 мл дополненного экстракционного буфера.
   4. Обработайте гранулы клеток ультразвуком, держа их на льду. Для каждой гранулы используйте следующие условия: 5 с ВКЛ, 5 с ВЫКЛ, продолжительность 5 мин, мощность 4-5.
   5. Соберите весь гомогенизированный лизат в стакан и добавьте АТФ (0,1 М стокового раствора; pH 7,0) так, чтобы конечная концентрация АТФ составила 1 мМ. Помешивать 15 минут в холодном помещении. АТФ диссоциирует активный миозин от актина, что позволяет отделить его на следующем этапе центрифугирования. Поэтому важно немедленно перейти к следующему шагу, чтобы свести к минимуму возможность истощения АТФ и повторного связывания с актином.
   6. Центрифугируйте лизаты при 48 000 x g в течение 1 ч при 4 °C. Пока это происходит, начните промывать 1-5 мл 50% суспензии смолы Anti-FLAG affinity (для гранулы, образованной из 1 л клеток) 100 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в соответствии с инструкциями производителя. Например, на 5 мл смолы смойте 10 мл 50% суспензии. На заключительном этапе промывки повторно суспендируйте смолу 1-5 мл PBS в объеме, достаточном для создания 50% суспензии.
   7. После центрифугирования лизата смешайте надосадочную жидкость с промытой смоляной суспензией и осторожно покачивайте в холодном помещении на 1-4 часа. Во время ожидания сделайте буферы, описанные в таблице 1, и держите их на льду.
2. Препарат аффинной очистки FLAG
   1. Центрифугируйте раствор на шаге 1,7 при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Смола будет упакована на дно тубы. Не нарушая смолу, удалите надосадочную жидкость.
   2. Ресуспендировать смолу в 50 мл буфера А, как описано в таблице 1, и центрифугировать при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Не нарушая смолу, удалите надосадочную жидкость.
   3. Повторно суспендируйте смолу в 50 мл буфера B, как описано в таблице 1, и центрифугируйте при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Повторите этот шаг еще раз и повторно суспендируйте смолу в 20 мл буфера B. Затем тщательно перемешайте смолу и буфер, осторожно перевернув трубку вручную примерно 10 раз.
3. Элюирование и концентрация белка
   1. Добавьте 30 мл элюирующего буфера, как описано в таблице 1, и дайте ему остыть на льду.
   2. Установите элюирующую колонну в холодном помещении. Аккуратно влейте в колонну смоляную суспензию. Промойте колонку 1-2 объемами буфера B по мере накопления смолы на дне, следя за тем, чтобы смола не высыхала.
   3. Пропустите 1 мл элюирующего буфера через смолу и соберите проточный раствор в пробирке объемом 1,5 мл. Повторите так, чтобы было собрано 12, 1 мл фракций.
   4. На этом этапе проведите грубый тест Брэдфорда на дробях, чтобы качественно определить, какие фракции являются наиболее концентрированными. На один ряд 96-луночного планшета нанесите пипетку 60 мкл 1x реагента Брэдфорда. По мере сбора фракций смешайте по 20 мкл каждой фракции на лунку. Более темно-синяя окраска указывает на более концентрированные фракции.
   5. В пробирке объемом 50 мл соберите оставшийся белок, осторожно проведя через колонку оставшийся элюирующий буфер, чтобы высвободить оставшийся миозин, связанный со смолой в проточной колонке. Этот поток будет сконцентрирован на следующем этапе. Убедитесь, что смола регенерируется для повторного использования и хранится в соответствии с инструкциями производителя.
   6. Объедините три наиболее концентрированные фракции и далее сконцентрируйте проточный поток в пробирке объемом 50 мл, а также оставшиеся фракции объемом 1 мл с помощью концентрационной пробирки мощностью 100 000 MWCO. Загрузите объединенный образец в концентрационную пробирку и центрифугу при давлении 750 x g в течение 15 мин при 4 °C и повторяйте до тех пор, пока весь элюированный белок не будет сконцентрирован до конечного объема примерно 0,5-1 мл
      заметка: Такой размер пор позволяет удерживать молекулы миозина, масса которых в несколько раз превышает отсечку по молекулярной массе. Легкие цепи остаются тесно связанными с моторными доменами в течение этого времени концентрации, что подтверждается проведением гель-электрофореза SDS-PAGE на конечном продукте.
4. Диализ и мгновенная заморозка
   1. Внесите 2 л диализного буфера, как описано в таблице 1. Загрузите образец в диализный мешок или камеру и проводите диализ в течение ночи в холодильной камере.
      заметка: В случае M5a-HMM, после ночного диализа, белок будет достаточно чистым для использования в последующих анализах. При необходимости могут быть выполнены дополнительные этапы очистки, такие как гель-фильтрация или ионообменная хроматография.
5. Восстановление миозина после диализа
   1. Для M5a-HMM тщательно соберите весь образец из диализной камеры и центрифугируйте при температуре 4 °C в течение 15 минут при 49 000 x g в случае присутствия нежелательных агрегатов. Примите надосадочную жидкость.
6. Определение концентрации и мгновенная заморозка
   1. Чтобы определить концентрацию продукта, измерьте поглощение с помощью спектрофотометра на длинах волн 260, 280, 290 и 320 нм. Рассчитайте концентрацию в мг/мл (c_мг/мл) с помощью уравнения 1, где A₂₈₀ представляет поглощение при 280 нм, а A₃₂₀ представляет поглощение при 320 нм. Полученная концентрация в мг/мл может быть преобразована в μМ молекул миозина с помощью уравнения 2, где М — молекулярная масса всего белка (включая тяжелые цепи, легкие цепи, флуорофоры и все метки).
      c_мг/мл = (A₂₈₀ - A₃₂₀) / ε (1)
      μM молекулы = 1000c_мг/мл/М (2)
      заметка: Если разведение необходимо, то его необходимо проводить в буфере с высокой ионной силой. Коэффициент экстинкции (ε) может быть определен путем импорта аминокислотной последовательности белка в программу, такую как ExPASy. Типичный выход для M5a-HMM составляет примерно 0,5-1 мл белка 1-5 мг/мл. Коэффициент экстинкции для M5a-HMM, использованный в этой статье, составил 0,671.
   2. Храните очищенный миозин одним из двух способов. Добавьте 10-20 μL в тонкостенную пробирку, такую как полимеризационная цепная реакционная трубка, и опустите пробирку в контейнер с жидким азотом для мгновенной заморозки. В качестве альтернативы можно напрямую пипетировать от 20 до 25 μл миозина в жидкий азот и хранить замороженные гранулы белка в стерильных криогенных пробирках. В любом случае полученные пробирки можно хранить при температуре -80 °C или в жидком азоте для использования впро><к. заметка: Поскольку описанный ниже анализ подвижности требует очень небольшого количества белка, хранение в небольших аликвотах, как описано, является экономичным.

2. Одномолекулярный анализ TIRF

1. Подготовка покровного стекла
   1. Разделите исходный порошок на 10 мг аликвот (в пробирках по 1,5 мл) метокси-Пег-силана (мПЭГ) и 10 мг аликвот биотин-Пег-силана (бПЭГ). Хранить при температуре -20 °C в герметичной, непроницаемой для влаги упаковке и использовать в течение 6 месяцев.
   2. Загрузите на решетку восемь квадратных покровных стекол No 1,5H (высокой точности) толщиной 22 мм и промойте 2-5 мл этанола 200-й крепости, а затем 2-5 мл дистиллированной воды. Повторите этот этап промывки, закончив водой. Затем полностью высушите покровные стекла с помощью воздушной линии или N₂ и очистите аргоном в течение 3 минут.
   3. Поместите чистые покровные стекла на фильтровальную бумагу (90 мм) в чашку для культуры тканей (100 x 20 мм) и инкубируйте в духовке при температуре 70 °C, выполняя следующие действия><. ПРИМЕЧАНИЕ: Плазменная очистка может быть заменена другими методами химической очистки.
   4. Приготовьте 80% раствор этанола с dH₂O и отрегулируйте pH до 2,0 с помощью HCl. Добавьте 1 мл этого раствора к 10 мг аликвоты mPEG и 1 мл к 10 мг аликвоты bPEG. Вихрь растворяется, на что не должно уйти более 30 с.
   5. Возьмите 100 μл раствора bPEG и добавьте 900 μл 80% этанола (pH 2,0). Этот раствор представляет собой 1 мг/мл бПЭГ. Затем приготовьте раствор обоих ПЭГ следующим образом, тщательно перемешивая.
      1. 200 мкл 10 мг/мл мПЭГ (конечная концентрация: 2 мг/мл).
      2. 10 мкл 1 мг/мл bPEG (конечная концентрация: 10 мкг/мл).
      3. 790 мкл 80% раствора этанола (pH 2,0).
   6. Достаньте покровные листы из духовки. Осторожно нанесите 100 мкл раствора PEG на центр каждого покровного стекла, следя за тем, чтобы только верхняя поверхность была влажной. Затем поместите листочки обратно в духовку и выдерживайте от 20 до 30 минут.
   7. Когда покровные стекла начнут приобретать дырявый вид, с небольшими кругами, заметными по всей поверхности, выньте их из духовки.
   8. Вымойте каждую крышку со 100% этанолом, высушите с помощью воздушной магистрали и снова поставьте в духовку. Инкубируйте только время, необходимое для создания камер на шаге 2.
2. Подготовка камеры
   1. Очистите предметное стекло микроскопа для использования при изготовлении камеры. Отрежьте два куска двустороннего скотча, примерно 2 см в длину.
   2. Поместите одну деталь вдоль середины длинного края предметного стекла микроскопа. Убедитесь, что край ленты совпал с краем предметного стекла. Поместите второй кусок ленты примерно на 2 мм ниже первого куска ленты так, чтобы они были параллельны и выровнены.
   3. Возьмите одну из функционализированных покровных крышек из духовки (созданную в версии 2.1). Осторожно наклейте покровное стекло на ленту таким образом, чтобы сторона, покрытая ПЭГ, была обращена вниз и соприкасалась с лентой, как показано на рисунке 1. С помощью наконечника для дозатора осторожно надавите на интерфейс ползунка-ленты, чтобы убедиться, что покровное стекло правильно приклеено к предметному стеклу.
   4. Срежьте лезвием бритвы лишнюю ленту, висящую над слайдом. Эти камеры можно использовать сразу или поместить попарно в пробирку объемом 50 мл и хранить в морозильной камере при температуре -80 °C для использования в будущем. Важно хранить сразу, иначе поверхность ухудшится.
3. Проведение микроскопического анализа миозина 5a TIRF
   1. Приготовьте растворы для анализа инвертированной моторики миозина 5а, описанного в таблице 2, и держите их на льду.
   2. Промойте камеру 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT.
   3. Расход в 10 мкл 1 мг/мл БСА в 50 мМ МБ с 1 мМ ДТТ. Повторите эту стирку еще два раза и подождите 1 минуту после третьей стирки. Используйте уголок папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы прокачать раствор через канал.
   4. Умойтесь 10 μL или 50 мМ MB с 1 mM DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
   5. Влейте 10 мкл раствора NeutrAvidin в 50 мМ МБ с 1 мМ DTT и подождите 1 мин.
   6. Умойтесь 10 μL или 50 мМ MB с 1 mM DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
   7. Влейте в 10 мкл биотинилированного родамина актина (bRh-Actin), содержащего 1 мМ DTT в 50 мМ MB и подождите 1 мин. Для этого шага используйте наконечник пипетки с большим отверстием и избегайте пипетирования вверх и вниз, чтобы свести к минимуму сдвиг флуоресцентных актиновых филаментов и обеспечить возможность прикрепления длинных актиновых филаментов к поверхности (20-30 мкм или более). Эффективной альтернативой является резка конуса стандартного наконечника для пипетки (с отверстием ≈1-1,5 мм).
   8. Умойтесь 10 μL или 50 мМ MB с 1 mM DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
   9. Влейте 30 мкл конечного буфера с добавлением 10 нМ миозина 5a, затем немедленно загрузите его в микроскоп TIRF и запишите после нахождения оптимального фокуса для метода визуализации TIRF. Время экспозиции от 100 до 200 мс является подходящим при мощности лазера 1,4 мВт для актина и GFP-меченного миозина. Подходящее время сбора данных для анализа скоростей составляет 3 минуты.

Таблица 1: Буферы, используемые для очистки белка.

Имя буфера	состав	Использованные шаги	Комментарии
M5a Буфер экстракции	0,3 млн NaCl	1.1	Держись на льду.
	15 мМ MOPS, pH 7,2
	15 мМ MgCl2
	1,5 мМ EGTA
	4,5 мМ NaN3
Буфер A	0,5 млн NaCl	2.2	Оставайтесь на льду.
	10 мМ MOPS, pH 7,2
	0,1 мМ EGTA
	3 мМ NaN3
	1 мМ АТФ
	1 мМ DTT
	5 мМ MgCl2
Буфер B	0,5 млн NaCl	2.3	Держись на льду.
	10 мМ MOPS, pH 7,2
	0,1 мМ EGTA
	3 мМ NaN3
	1 мМ DTT
Буфер элюирования	0,5 млн NaCl	3.1	Оставайтесь на льду.
	0,5 мг/мл пептида FLAG
	10 мМ MOPS, pH 7,2
	0,1 мМ EGTA
	3 мМ NaN3
	рН 7,2
M5a Диализный буфер	500 мМ KCl	4.1	Используйте холодный dH2O для увеличения объема.
	10 мМ MgCl2
	10 мМ MOPS, pH 7,2
	0,1 мМ EGTA
	1 мМ DTT

Таблица 2: Буферы, используемые в анализе TIRF.

Имя буфера	состав	Использованные шаги	Комментарии
4X Буфер подвижности (4X MB)	80 мМ MOPS, pH 7,2		Вакуумный фильтр и хранение при 4°C
	20 мМ MgCl2
	0,4 мМ EGTA
	рН 7,4
50 мМ Буфер подвижности соли (50 мМ МБ)	25% по сравнению с 4X MB		Вакуумный фильтр и хранение при температуре 4°C
	50 мМ KCl
	Увеличение громкости с помощью dH2O
Буфер подвижности соли 150 мМ (150 мМ МБ)			Вакуумный фильтр и хранение при температуре 4°C
Миозин		Смотрите рецепт "Финальный буфер"	Держите на льду.
2 мг/мл NeutrAvidin	2 мг/мл NeutrAvidin	3.5	Оставайтесь на льду.
	1 мМ DTT
	Разведение в 50 мМ МБ
1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА)	1 мг/мл БСА	3.3	Оставайтесь на льду.
	1 мМ DTT
	Разведение в 50 мМ МБ
>200 нМ родамин-фаллоидин биотинилированный F-актин (bRh-актин)	200 нМ родамин-фаллоидин биотинилированный F-актин	3.7	Избегайте сдвига, не делая вихри или пипетирование вверх и вниз. Чтобы перемешать, аккуратно переверните.
	1 мМ DTT
	Разведение в 50 мМ МБ
MB с DTT	50 мМ DTT	3.2, 3.4, 3.6, 3.8	Оставайтесь на льду.
	Разведение в 50 мМ МБ
Последний буфер	50 мМ KCl	3.9	Добавьте глюкозу, глюкозооксидазу и каталазу непосредственно перед проведением эксперимента. Держите на льду.
	20 мМ MOPS, pH 7,2
	5 мМ MgCl2
	0,1 мМ EGTA
	1 мМ АТФ
	50 мМ DTT
	1 мкМ кальмодулин
	2,5 мг/мл глюкозы
	100 мкг/мл глюкозооксидазы
	40 мкг/мл каталазы
	10 нМ миозин

Результаты

Рисунок 1: Подготовка функционализированных проточных камер.(А) Начните с очищенного предметного стекла микроскопа, двух кусков двустороннего скотча, обрезанных примерно до 2 см, и функционализированного покровного стекла. (B) Добавьте ленту в центр предметного стекла микроскопа. (C) Прикрепите покровное стекло к ленте покрытием вниз и аккуратно приж...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2 М раствор MgCl2	ВВР	10128-298
5 М раствор NaCl	КД Медикал	РГЭ-3270
уксусная кислота	ThermoFisher Scientific	984303
Anti-FLAG M2 Affinity Гель	Миллипора Сигма	А2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
СПС	Миллипора Сигма	А7699
Биотинилированный G-актин	Цитоскелет, Инк.	АБ07
Бычий сывороточный альбумин	Миллипора Сигма	5470
bPEG-силан	Лайсан Био, Инк	Биотин-ПЭГ-СИЛ-3400-1г
Концентрат реагентов Bradford	Био-Рад	5000006
Кальмодулин		PMID: 2985564
Каталазы	Миллипора Сигма	С40
Клеточная линия (Sf9) в SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Круглая фильтровальная бумага - Инвертированный анализ	Миллипора Сигма	WHA1001090
Полнорационные таблетки ингибитора протеазы без ЭДТА	Миллипора Сигма	5056489001	Его следует хранить при температуре 4 °C. Таблетки можно использовать непосредственно или восстанавливать в виде 25-кратного исходного раствора путем растворения 1 таблетки в 2 мл дистиллированной воды. Полученный раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение 1-2 недель или не менее 12 недель при -20 °C.
Обогатительные трубы (100 000 MWCO)	Корпорация EMD Millipore	UFC910024	MWCO в трубке не обязательно является «универсальным», если MWCO меньше общей молекулярной массы очищаемого белка. M5a был концентрирован с помощью трубки мощностью 30 000 МВт.
Краситель Coomassie Brilliant Blue R-250	ThermoFisher Scientific	No 20278
Стеллаж Coverslip	Миллипора Сигма	Z688568-1 шт.
Покровные стекла: анализ инвертированной моторики	Азер Сайентифик	ES0107052
Диализная трубка (3500 Dalton MCWO)	Научный Фишер	08-670-5А	Диаметр диализной трубки может варьироваться, но MWCO должен быть одинаковым. Пробирки можно хранить в 20% спиртовом растворе при температуре 4 °C.
DL-дитиотреитол	Миллипора Сигма	Д0632
Двусторонний скотч	Офисное депо	909955
Пептид DYKDDDDK	GenScript	RP10586	Его можно растворить в буфере, содержащем 0,1 М NaCl, 0,1 мМ EGTA, 3 мМ NaN3 и 10 мМ MOPS (pH 7,2) до конечной концентрации 50 мг/мл. Его можно хранить при температуре -20 °C в виде 300 μл аликвот.
ЭГТА	Миллипора Сигма	Е4378
Элюирующая колонна	Био-Рад	761-1550	Их можно использовать повторно. Для очистки промыть колонку 2-3 колонными объемами PBS и дистиллированной водой. Перед использованием охладите колонку до 4° C.
этанол	Научный Фишер	А4094
глюкоза	Миллипора Сигма	Г8270
Глюкозооксидаза	Миллипора Сигма	Г2133
Буферный раствор глицина, 100 мМ, pH 2-2,5, 1 л	Санта Крус Биотехнологии	СК-295018
список совместимого оборудования	Миллипора Сигма	320331
KCl	Научный Фишер	П217-500
Наконечники пипеток с большими отверстиями	Научный Фишер	02-707-134 (Английский
Ингибитор лейпептина протеазы	ThermoFisher Scientific	No 78435
Mark12 Стандартная лестница без пятен	ThermoFisher Scientific	ЛК5677
метанол	Миллипора Сигма	МХ0482
Предметные стекла для микроскопа	Научный Фишер	12-553-10
Швабры	Научный Фишер	БП308-100
mPEG-силан	Лайсан Био, Инк	MPEG-SIL-2000-1g
НаН3	Миллипора Сигма	С8032
НейтрАвидин	ThermoFisher Scientific	No 31050
NuPAGE 4 до 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15 лунок	ThermoFisher Scientific	NP0323PK2
Образец буфера NuPAGE LDS (4X)	ThermoFisher Scientific	НП0007
Фосфатно-солевой буфер, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	10010023
ПМСФ	Миллипора Сигма	78830	PMSF может быть изготовлен в виде 0,1 М стокового раствора в изопропаноле и храниться при температуре 4 °C. Добавление изопропанола приводит к выпадению кристаллов, которые можно растворить при перемешивании при комнатной температуре. Непосредственно перед применением PMSF можно добавлять по каплям в быстро перемешиваемый раствор до конечной концентрации 0,1 мМ.
Лезвия	Офисное депо	397492
Родамин-фаллоидин	ThermoFisher Scientific	Р415	Исходный материал может быть разбавлен в 100% метаноле до конечной концентрации 200 мкМ.
Sf9 Медиа	ThermoFisher Scientific	12658-027	Хранить следует при температуре 4° C. Срок его годности составляет 18 месяцев с момента изготовления.
Чашка для культивирования тканей - инвертированный анализ	Корнинг	353003	Каждая чашка для культуры тканей может вместить примерно четыре покровных стекла.
Наконечники для пипеток с гладкими стенками объемом 200 мкл	Томас Сайенти	1158У38
оборудование
центрифуга	ThermoFisher Scientific	75006590
микроскоп	Компания Nikon	Модель: Eclipse Ti с системой H-TIRF со 100-кратным объективом TIRF (N.A. 1.49)
Камера для микроскопа	Андор	Модель: камера iXon DU888 EMCCD (формат сенсора 1024 x 1024)
Коробка контроля окружающей среды для микроскопа	Токай ХИТ	Термобокс на заказ
Лазерный блок для микроскопа	Компания Nikon	LU-n4 четырехлазерный блок с твердотельными лазерами для 405 нм, 488 нм, 561 нм и 640 нм
Центрифуга среднего стола	ThermoFisher Scientific	Модель: CR3i
Ультразвуковой аппарат Misonix	Мисоникс	XL2020
Настольная ультрацентрифуга Optima Max-XP	Бекман Коултер	393315
Плазменный очиститель	Diener electronic GmbH + Co. KG	Тип системы: Zepto
Ультразвуковой щуп (3,2 мм)	Qsonica	No 4418
Стандартный инкубатор	сноповязалка	Модель: 56
Трубчатый смеситель Waverly	Уэверли	ТР6Е

гг. )