$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом
1. Пассивная сенсибилизация клеток huRBL
- Центрифугируйте предварительно инкубированную суспензию Ag8/сыворотки в течение 5 мин при 250 x g.
- Перенесите 50 мкл центрифугированной суспензии Ag8/сыворотки в каждую лунку, содержащую клетки huRBL, не нарушая гранулу клеток Ag8.
- Включают в контроль без антигена, которые являются сенсибилизированными, но нестимулированными клетками (не добавляют антиген), служащими индикатором нижнего сигнального плато/фона. Контрольные лунки фонового и максимального лизиса не нуждаются в сенсибилизации сывороткой. Вместо этого добавьте 50 μL среды huRBL для контроля лунок.
- Накройте тарелку крышкой и выдерживайте в течение ночи при 37 °C и 5%-7%CO2.
2. Антиген-стимулированная дегрануляция и высвобождение медиаторов
- Заранее приготовьте разведение антигена в 1x Tyrode's buffer (9,5 г/л солей Tyrode, 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,5 г/л гидрокарбоната натрия (NaHCO3) в dH2O). Окончательное количество необходимо в 100 мкл на лунку.
заметка: Не каждый аллерген, очищенный из природных источников или полученный рекомбинантно, может быть стабильным в буфере 1x Tyrode. Поэтому перед процедурой анализа проведите испытания на стабильность в буфере 1x Tyrode. В качестве альтернативы можно разбавить 1x буфер Tyrode в оксиде дейтерия (D2O) для увеличения отношения сигнал/шум в анализе.
- Сделайте 8 разведений представляющего интерес антигена серии разведения 1:10 в реакционных пробирках, начиная с 10 или 1 мкг/мл белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда проверяйте серию разведения заранее. В качестве альтернативы можно адаптировать серию разбавления 1:10 (например, 1:5, 1:20 или 1:30) для охвата полной кривой срабатывания. Кроме того, начальная концентрация может варьироваться в зависимости от экспериментальной установки.
- Чтобы промыть клетки huRBL, нанесенные на 96-луночный планшет, сначала удалите сераторосодержащую клеточную среду, осторожно отсасывая, инвертируя и постукивая пластиной по абсорбирующей бумаге.
- Промойте ячейки 200 μл 1x Tyrodes' буфера на лунку. Относитесь ко всем колодцам одинаково.
заметка: Медленно добавляйте моющий раствор в клетки, чтобы не беспокоить их.
- Оставьте примерно на 30 с и повторите этап стирки в общей сложности три раза.
- После добавления промывочного раствора в последний раз оставьте раствор в лунках до тех пор, пока он не будет готов, чтобы продолжить добавление разбавления антигена.
заметка: Избегайте слишком длительного контакта клеток с воздухом.
- Перенесите 100 мкл раствора антигена в каждую лунку, содержащую предварительно сенсибилизированные клетки huRBL.
ПРИМЕЧАНИЕ: При анализе нескольких различных параметров перенесите отдельные образцы серии разведения в дополнительный необязательный 96-луночный планшет (используйте ту же схему, что и на планшете huRBL), а затем перенесите их с помощью многоканальной пипетки непосредственно на клеточный планшет huRBL. Таким образом, можно избежать слишком длительного контакта клеток с воздухом, что может привести к снижению эффективности анализа (более низкий сигнал или его отсутствие).
- Покройте контрольные лунки (максимальный лизис и несенсибилизированные фоновые клетки) 100 мкл 1x Тиродова буфера. Не стимулируйте эти контрольные лунки антигеном.
- Кроме того, добавьте 100 мкл 1x Tyrode's буфера в сенсибилизированные лунки без антигена серии разведения, что необходимо для учета антиген-независимого спонтанного высвобождения сенсибилизированных клеток при анализе данных.
- Инкубируйте клетки huRBL в течение 1 ч при 37 °C и 5%-7%CO2.
3. Флуоресцентное измерение активности β-гексозаминидазы
- Обработайте лунки для контроля максимального лизиса 10 мкл 10% Triton X-100 на лунку и тщательно перемешайте, чтобы полностью лизировать клетки и получить 100% высвобождение β-гексозаминидазы.
- Добавьте 50 мкл раствора подложки в новый несвязывающий 96-луночный планшет. Субстратный раствор для одного 96-луночного планшета: 5 мл 0,1 М лимонного буфера, pH 4,5; и 80 мкл 10 мМ 4-метилумбеллиферила N-ацетил-β-D-глюкозаминида.
- Перенесите 50 μL надосадочной жидкости клеток всех лунок на новую пластину, содержащую раствор субстрата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно пипетируйте надосадочную жидкость с планшета huRBL, чтобы не нарушить клетки huRBL.
- Инкубируйте планшет с раствором субстрата и надосадочной жидкостью клеток в течение 1 ч при 37 °C, чтобы обеспечить конверсию флюорогенного субстрата.
заметка: Сохраняйте планшет huRBL для анализа жизнеспособности клеток.
- Добавьте 100 мкл останавливающего раствора (15 г/л глицина, 11,7 г/л NaCl, растворенного в dH2O, pH 10,7) на лунку.
- Измерьте флуоресценцию при возбуждении 360 нм и излучении 465 нм с помощью считывателя пластин.