Методическая статья

Анализ жизнеспособности люциферазы на основе АТФ: однородный метод оценки ингибиторного потенциала тест-агентов на опухолевых органоидах

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Higa, A. et al. Высокопроизводительный анализ in vitro с использованием органоидов опухолей, полученных от пациента. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео мы демонстрируем быстрый анализ с однократным добавлением для оценки жизнеспособности клеток в органоидах, полученных от пациента, после обработки тест-агентом, использующим внутриклеточные уровни АТФ в качестве маркера клеточной метаболической активности. Внутриклеточные уровни АТФ измеряют с помощью реакции люцифераза/люциферин, где интенсивность излучаемого света указывает на жизнеспособность клеток и, в свою очередь, на активность тестируемого агента по ингибированию роста.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Высокопроизводительный скрининг ингибирования роста (HTS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибиторная активность роста противоопухолевых агентов против опухолевых органоидов (PDO) пациента оценивается путем измерения внутриклеточного содержания АТФ, как показано на рисунке 1. Этот этап выполняется с использованием коммерчески доступного набора для анализа жизнеспособности клеток (см. Таблицу материалов).

  1. В день 0 культивируйте PDO (например, RLUN007) в колбах до тех пор, пока не будет доступно достаточное количество клеточных кластеров для анализа. За сутки до посева перенесите суспензию PDO из колбы75 см 2 в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 200 x g в течение 2 мин для измерения объема гранул PDO. Затем повторно суспендируйте гранулу PDO в 15 мл свежей среды и переложите ее обратно в колбу размером75 см 2 см. Культивировать клетки при 37 °C в 5% CO2,
    заметка: Требуемый объем гранул PDO зависит от скорости разведения каждого PDO и количества 384-луночных планшетов, используемых для анализа. Для RLUN007 необходимо 200 мкл объема гранул ячеек для засеивания в десять 384-луночных планшетов.
  2. В 1-й день (через 24 ч после смены среды) измельчите PDO с помощью оборудования для фрагментации и диспергирования клеток (см. Таблицу материалов) с фильтродержателем, содержащим сетчатый фильтр 70 мкм. Затем разбавьте 15 мл суспензии PDO в 10 раз. Засейте 40 мкл суспензии PDO в 384-луночные микропланшеты со сфероидом со сверхнизким уровнем прикрепления (с круглым дном) (см. Таблицу материалов) с помощью дозатора суспензии ячеек (см. Таблицу материалов).
    заметка: Для измельчения кластеров ячеек рекомендуется использовать имеющееся в продаже оборудование для фрагментации и диспергирования ячеек (см. Таблицу материалов).
  3. Через 24 ч после посева (день 2) обработайте PDO 0,04 мкл растворов испытуемого агента в диапазоне конечных концентраций от 20 мкМ до 1,0 нМ (10 последовательных разведений) с помощью манипулятора для жидкостей (см. Таблицу материалов).
  4. На 8-е сутки (через 144 ч после обработки исследуемым веществом) добавить в исследуемые лунки внутриклеточный реагент для измерения АТФ. Перемешайте планшеты с помощью миксера и инкубируйте в течение 10 мин при 25 °C. Измерьте внутриклеточное содержание АТФ в виде люминесценции с помощью планшетного ридера (см. Таблицу материалов).
  5. Чтобы рассчитать жизнеспособность ячейки, разделите количество АТФ в испытательных лунках на количество в контрольных лунках, в которых находится транспортное средство, с вычитанием фона. Чтобы рассчитать скорость роста за 6 дней, разделите количество АТФ в контрольных лунках транспортного средства на количество в контрольных лунках транспортного средства через 24 часа после посева.
  6. Рассчитайте значения 50% ингибирующей концентрации (IC50) и площади под кривой (AUC) по кривым "доза-реакция" с помощью программного обеспечения для анализа биологических данных (см. Таблицу материалов). Коэффициент Z — это безразмерный параметр, который находится в диапазоне от 1 (бесконечное расстояние) до <0, определяемый как Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, где σc+, σc-, μc+ и μc- - являются стандартными отклонениями (σ) и средними значениями (μ) высокого (c+) и низкого (c−) контроля, соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Краткое описание протокола, использованного для создания высокопроизводительной системы анализа с использованием 384-луночных микропланшетов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
384-луночный сфероидный микропланшет со сверхнизким креплениемКорнинг4516Пластины для HTS
Среда для наращивания раковых клеток плюсFujifilm Wako Pure Chemical032-25745 (АнглийскийСреда для F-PDO
СеллПет ФТJTEC- TОборудование для фрагментации и диспергирования клеток
CellTiter-Glo 3D анализ жизнеспособности клетокКомпания PromegaГ9683Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток, реагент для измерения внутриклеточной АТФ
Эхо 555Лабцит- TМанипулятор для работы с жидкостями
ЭнСпайрПеркинЭлмер- TСчитыватель пластин
Программное обеспечение Morphit, версия 6.0Консалтинговая компания по периферийному программному обеспечениюПрограммное обеспечение для анализа биологических данных
Многоточечный комбиThermoFisher Scientific5840300 (АнглийскийДозатор клеточной суспензии
RLUN007Fujifilm Wako Pure Chemical или Summit Pharmaceuticals InternationalF-PDO от опухоли легких
Сверхнизкая насадка 75 см² колбаКорнингNo 3814Колба для культур для PDO
) )

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи