1. Получение лизатов цельных клеток
- Инокулируйте штаммы коллекции E. coli K-12 ASKA ORFeome в 1,5 мл бульона Lysogeny (LB), содержащего 25 мкг/мл хлорамфеникола, в 96-луночных глубоких лунках. Выращивание в течение ночи (O/N) в течение 18 часов при 30 °C с встряхиванием при 160 об/мин. На следующий день добавьте изопропил β-d-1-тиогалактопиранозид (IPTG) (последние 0,5 мМ) к культурам O/N, чтобы индуцировать экспрессию белка при 30 °C в течение 6 ч.
- Ячейки для пеллет при температуре 500 x g в течение 10 мин. Заморозьте гранулы при температуре -80 °C до использования. Чтобы лизировать клетки, добавьте 150 мкл лизисного буфера L1 (40 мМ Tris pH 7,5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, дополненный 2 мМ фенилметилсульфонилфторидом (PMSF), 40 мкг/мл ДНКазы 1 и 0,5 мг/мл лизоцима) для ресуспендирования пеллеты.
- Заморозьте клетки при температуре -80 °C на 30 минут, а затем разморозьте при 37 °C в течение 20 минут. Повторите этот цикл три раза, чтобы лизировать клетки. Перед использованием храните лизаты при температуре -80 °C.
2. Очистка Relseq и GppA
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантные белки Relseq от Streptococcus equisimilis и GppA от E. coli K-12 используются для синтеза меченых pppGpp и ppGpp соответственно.
- Выращивайте и собирайте клетки, сверхэкспрессирующие каждый белок.
- Вырастите штамм E. coli BL21 DE3 до экспоненциальной фазы (оптическая плотность (OD) ~0,3-0,4) в бульоне LB и открутите 1 мл культуры при 6000 x g в течение 5 мин. Сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 100 мкл ледяного бульона TSB (бульон LB с добавлением 0,1 г/мл PEG3350, 0,05 мл/мл диметилсульфоксида, 20 мМ MgCl2).
- Смешайте плазмиды, содержащие меченные гистидином relseq и gppA, каждая по 100 нг, с вышеуказанными клеточными суспензиями в TSB и инкубируйте на льду в течение 30 мин. Подвергайте клетки тепловому шоку при 42 °C в течение 40 с. Поместите смесь на лед на 2 мин и добавьте 1 мл бульона LB комнатной температуры, чтобы позволить клеткам восстановиться в течение 1 ч при 37 °C с перемешиванием при 160 об/мин.
- Планшет с восстановленными клетками на агаровых планшетах LB с добавлением соответствующих антибиотиков (Relseq: 100 мкг/мл ампициллина; GppA: 30 мкг/мл канамицина). На следующий день инокулируйте колонии в LB-бульон, чтобы начать O/N прекультуры обоих штаммов при 37 °C.
- Через 18 ч инокулируют 500 мл среды LB с 10 мл культур O/N и соответствующими антибиотиками. Выращивайте культуры, встряхивая при 160 об/мин при 37 °C. Когда наружный диаметр600 нм достигнет 0,5-0,7, индуцируйте экспрессию белка, добавив 0,5 мМ IPTG и выращивая в течение 3 ч при 30 °C с встряхиванием при 160 об/мин.
- Соберите клетки путем вращения при 6084 x g в течение 10 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте гранулу в 20 мл ледяного 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) и повторно центрифугируйте при 1912 x g в течение 20 мин при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость и заморозьте гранулы при -20 °C перед использованием.
- Аффинная очистка никель-нитрилотриуксусной кислотой (Ni-NTA)
заметка: С этого момента следите за тем, чтобы образцы были холодными.
- Добавьте 40 мл ледяного буфера для лизиса L2 (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5% глицерина, 10 мМ имидазола, 10 мМ β-меркаптоэтанола с добавлением ингибиторов протеазы (таблетка без ЭДТА; см. Таблицу материалов) для ресуспендирования пеллеты. Лизируйте клетки с помощью ультразвука (амплитуда 60%, 2 с ВКЛ / 4 с ВЫКЛ в течение 8 мин ВКЛ). Очистите лизат путем вращения при температуре 23 426 x g в течение 40 минут при 4 °C и продолжайте использовать надосадочную жидкость для очистки.
- Во время вышеупомянутого центрифугирования приготовьте смолу Ni-NTA.
- Перелейте 500 μл гомогенизированной смолы Ni-NTA в стоячую полипропиленовую хроматографическую колонку и дайте ей отстояться в течение 15 минут, пока раствор для хранения не стечет. Промойте смолу 15 мл сверхчистой воды дважды, а затем промойте колонку 15 мл буфера для лизиса L2.
- Загрузите очищенный надосадочный слой клеточного лизата из шага 1 в колонку и дайте ему пройти. Промойте колонку 30 мл промывочного буфера (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5% глицерина, 20 мМ имидазола).
- Разбавьте белки 400 мкл элюирующего буфера (50 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5% глицерина, 500 мМ имидазола) три раза. Затем повторите элюирование еще 300 мкл элюирующего буфера. Соедините элюированные белки до конечного объема 700 μл.
- Фильтрация гелем
- Приготовьте гелевый фильтрационный буфер (50 мМ Трис, pH 7,5; 200 мМ NaCl; 5% глицерина). Промойте колонку исключения размера одной колонкой объемом (25 мл) буфера для фильтрации геля.
- Загрузите вышеуказанный образец объемом 700 мкл с помощью петли объемом 500 мкл, запущенной со скоростью 0,5 мл/мин, и соберите 2-3 фракции, каждая объемом 0,5 мл, содержащие соответствующие белки.
- Соедините и сконцентрируйте фракции, содержащие каждый из белков, с помощью спиновой колонки, и измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
3. Синтез 32P-меченых pppGpp и ppGpp
- Соберите мелкомасштабную реакцию Relseq в пробирке с винтовой крышкой (см. Таблицу 1).
заметка: Работайте с радиоактивными реактивами только в лицензированном месте и со средствами индивидуальной защиты.
- Инкубируйте пробирку при 37 °C в термомиксере в течение 1 ч, затем при 95 °C в течение 5 мин и поместите на лед на 5 мин. Уменьшите осажденный белок при 15 700 x g в течение 5 мин и перенесите надосадочную жидкость (синтезированную 32P-pppGpp) в новую пробирку с завинчивающейся крышкой.
- Чтобы синтезировать 32P-ppPGpp из 32P-ppppGpp, перенесите половину продукта 32P-pppGpp в новую пробирку с завинчивающейся крышкой и добавьте 1 мкМ GppA. Инкубируйте пробирку при температуре 37 °C в течение 10 минут, при 95 °C в течение 5 минут, а затем поместите на лед на 5 минут.
- Уменьшите осажденный белок при 15 700 x g в течение 5 минут и перенесите надосадочную жидкость (синтезированную 32P-ppGpp) в новую пробирку с завинчивающейся крышкой.
- Проанализируйте 32P-pppGpp и 32P-ppGpp, пропустив 1 мкл образцов на тонкослойном хроматографическом планшете (TLC) (полиэтиленимин-модифицированные целлюлозные пластины TLC) с использованием 1,5 M KH2PO4, pH 3,4, в качестве подвижной фазы.
заметка: Используйте гуанозин-5'-трифосфат с α-32P-меченым (32P-α-GTP) в качестве контроля.
- Полностью высушите пластину TLC, поместите ее в прозрачную пластиковую папку и подвергните воздействию люминофорного экрана на 5 мин. Визуализируйте и количественно оцените сигналы с помощью люминоформирователя.
заметка: Когда соотношения 32P-ppGpp и 32P-ppGpp превышают 85%, можно собрать и синтезировать крупномасштабную реакцию (500 μL, достаточно для скрининга 20 96-луночных планшетов) с использованием таблицы 1.
4. Скрининг DRaCALA целевых белков (p)ppGpp
- Разморозьте и перенесите 20 мкл цельных клеточных лизатов на 96-луночный планшет для микротитров с V-образным дном. Добавьте 2,5 U/лунку эндонуклеазы из Serratia marcescens и инкубируйте при 37 °C в течение 15 минут для снижения вязкости лизата. Поместите лизаты на лед на 20 минут.
- Смешайте 32P-ppGpp и 32P-ppGpp в соотношении 1:1 и добавьте 1x буфер для лизиса L1, чтобы конечная концентрация (p)ppGpp была равна 4 нМ.<бр/>
заметка: Учитывая химическое сходство между pppGpp и ppGpp, сочетание обоих химических веществ упростит процесс скрининга.
- С помощью многоканальной пипетки и отфильтрованных наконечников для пипетки добавьте и смешайте 10 мкл смеси (p)ppGpp с лизатом клеток. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут.
- Промойте инструмент 96 x pin , поместив его в 0,01% раствор неионогенного моющего средства на 30 с, и высушите его на папиросной бумаге в течение 30 с. Повторите стирку инструмента 3 раза.
- Поместите штифтовый инструмент в вышеуказанные 96-луночные планшеты для образцов и подождите 30 с. Поднимите штифтовый инструмент прямо вверх и поместите его прямо вниз на нитроцеллюлозную мембрану на 30 с.<бр/>
заметка: Если пятно отсутствует, найдите 2 мкл соответствующих образцов с помощью пипетки и отфильтрованных наконечников. Желательно сделать дубликат пятна из того же образца, как указано ниже.
- Высушите мембрану в течение 5 минут при температуре RT. Поместите мембрану между прозрачной пластиковой папкой и поместите ее на накопительный люминофорный экран на 5 минут. Визуализируйте с помощью фофорформирователя.
5. Количественная оценка и идентификация потенциальных белков-мишеней
- Используйте программное обеспечение для анализа, связанное с фосфорформирователем, чтобы открыть файл .gel визуализированных пластин. Используйте функцию анализа массива для определения 96 точек, настроив сетку из 12 столбцов x 8 строк.
- Определите большие круги, чтобы описать внешний край целых пятен (см. Рисунок 1). Экспортируйте объем+фон и область определенных больших кругов и сохраните их в таблице.
заметка: При необходимости переместите каждый отдельный круг так, чтобы он идеально перекрывался с пятнами, и измените размер каждого отдельного круга, чтобы он был немного больше фактического пятна.
- Уменьшите размер определенных кругов, чтобы очертить маленькие внутренние точки. Экспортируйте Объем + Фон и Площадь определенных маленьких кругов и сохраните их в электронной таблице.
- Рассчитайте дроби связывания в таблице с помощью уравнения на рисунке 1 и постройте данные на график. Определите потенциальные связывающие белки в лунках, которые демонстрируют высокие фракции связывания по сравнению с большинством других лунок.
Таблица 1: Сбор информации для мало- и крупномасштабных реакций синтеза 32P-меченых pppGpp. *10x Relseq buffer содержит 250 мМ Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 мМ MgCl2. Аббревиатура: pppGpp = пентафосфат гуанозина.
| Объем (μл) |
| Малый масштаб | Крупномасштабных |
| Сверхчистая вода | | |
| 10x буфер Relseq* | 2 | 50 |
| ATP (8 mM final) | | |
| Релсек (4 μМ финал) | | |
| 32-α-гуанозинтрифосфат (ГТФ) (конечные 120 нМ) (ВНИМАНИЕ) | 0,2 | 5 |
| итог | 20 | 500 |
