Флуоресцентный зондовый визуализирующий анализ: метод визуализации окислительного стресса в культивируемых кишечных органоидных клетках, обработанных индукторами активных форм кислорода

Аннотация

Источник: Stedman, A. et al., Анализ окислительного стресса в органоидах кишечника мышей с помощью чувствительного к активным видам кислорода флюорогенного зонда. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео описывает технику визуализации окислительного стресса в культивируемых органоидах. Эта работа помогает понять уровень окислительного стресса из-за накопления АФК в различных типах клеток, присутствующих в органоиде после обработки различными модуляторами АФК.

Протокол

1. Визуализация окислительного стресса в 3D-органоидах с помощью конфокальной микроскопии

1. Возьмите органоиды, нанесенные в μ-слайдовые 8-луночные камеры, и добавьте 1 мкл N-ацетилцистеина или стокового раствора NAC в соответствующие лунки для получения конечной концентрации 1 мМ.
2. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO₂.
3. Добавьте 1 мкл стокового раствора tBHP в соответствующие лунки для получения конечной концентрации 200 мкМ.
4. Инкубировать в течение 30 минут при 37 °C и 5% CO₂.
5. Добавьте 1 μL на лунку разведения 1,25 мМ флуорогенного зонда для получения конечной концентрации 5 μМ.
6. Добавьте 1 мкл на лунку разбавления Hoechst в концентрации 1,25 мг/мл для получения конечной концентрации 5 мкг/мл.
7. Инкубировать в течение 30 минут при 37 °C и 5% CO₂.
8. Удалите среду, не нарушая BMM. Аккуратно добавьте 250 мкл теплого DMEM без фенола красный.
   заметка: Если планируется долгосрочное приобретение, добавьте в DMEM соединения факторов роста без фенолового красного.
9. Визуализируйте органоиды с помощью конфокального микроскопа, оснащенного термокамерой и подачей газа, который обнаруживает флуорогенный зонд (АФК).
   заметка: Возбуждение/излучение (ex/em) для флуорогенного зонда составляет 644/665, ex/em для Hoechst (ядра) — 361/486, а ex/em для GFP (кишечные стволовые клетки мышей Lgr5-GFP) — 488/510. Для обнаружения сигналов в стволовых клетках используется 63-кратный масляный иммерсионный объектив. Не изменяйте настройки лазера между образцами. Цель 20x может использоваться для получения обзора производства ROS.
10. Используйте положительный регулятор для настройки интенсивности лазера и времени экспозиции для сигнала АФК и убедитесь, что этот сигнал ниже в отрицательном контроле.
11. С помощью окуляра просмотрите предметное стекло, чтобы определить экспрессию органоидов GFP и отрегулировать интенсивность лазера.
    заметка: Этот шаг выполняется вручную.
12. Определите позиции для получения сшитого изображения всего органоида. Установите z-стек размером 25 мкм (размер шага 5 мкм), чтобы получить сечение органоидов, показывающее один слой клеток.
    заметка: Обратитесь к руководству пользователя микроскопа для оптимизации настройки. Используя живые клетки, приобретение должно быть произведено в течение 1 ч после окончания инкубации.
13. Откройте изображения в программном обеспечении для обработки изображений с открытым исходным кодом (см. Таблицу материалов).
14. Пройдитесь по z-стеку и выберите секцию, в которой хорошо представлена середина органоидов, и создайте новое изображение с выбранной областью.
15. Количественно оцените изображения в соответствии со следующими шагами.
    1. Выберите инструмент «Линия от руки».
    2. Проведите линию по ядрам.
       заметка: Выбирайте только регионы, содержащие GFP-положительные клетки, если анализируются только стволовые клетки.
    3. Увеличьте ширину линии, чтобы покрыть слой ячейки линией без включения светового мусора.
    4. Выберите канал для сигнала ROS, измерьте интенсивность флуоресценции в выбранной области и аннотируйте значения.
    5. Проведите линию там, где нет сигнала, и измерьте интенсивность флуоресценции фона, которая будет вычтена из предыдущего значения, чтобы получить итоговую интенсивность.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мышей
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5- GFP)	Лаборатория Джексона
Питательная среда
Усовершенствованный DMEM F12 (DMEM/F12)	ТермоФишер	12634010
Пенициллин-стрептомицин (/с)	ТермоФишер	15140122	Исходная концентрация: 100x (10 000 ЕД/мл пенициллина и 10 000 мкг/мл стрептомицина)
FLuoroBrite DMEM (DMEM без фенола красного)	ТермоФишер	A1896701
Hoechst 33342	ТермоФишер	Н3570	запас в концентрации 10 мг/мл
Уменьшенный фактор роста Матригель, фенол не содержит красного (матрица базальной мембраны)	Корнинг	356231	После получения оттаивания в холодильнике держите в течение 1 часа на льду и приготовьте 500 мл аликвот и храните при температуре -20 °C
μ-Slide 8 Луночные камеры	Там же	80826
N-ацетилцистеин (NAC)	сигма	А9165
раствор трет-бутилгидропероксида (tBCHP) (70% масс. В H2O2)	сигма	458139
Программы и оборудование
Фиджи/ImageJ			https://imagej.net/software/fiji/ загрузки Генерация изображений
Наблюдатель.Z1	Цейсс		Конфокальная система
Opterra (фокус со стреловидным полем)	Брукер		Конфокальная система
высокоскоростная камера EMCCD Evolve Delta 512	Фотометрия		Конфокальная система
призма	Программное обеспечение GraphPad		статистический анализ