Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка реагентов и материалов для культивирования кишечных органоидов
- Для приготовления питательной среды смешайте усовершенствованный DMEM/F-12 с добавлением 1x глутамина, 1x раствора пенициллина/стрептомицина (P/S), 10 мМ HEPES, 50 нг/мл мышиного EGF, 20 мкг/мл мышиного Noggin и 500 нг/мл мышиного R-Spondin1 (см. Таблицу материалов). Оставьте среду при комнатной температуре (RT) во время извлечения из склепа.
заметка: Неиспользованную среду заморозьте в аликвотах при температуре -20 °C. Не допускайте замерзания и размораживания.
- Наполните пробирку объемом 50 мл 40 мл Advanced DMEM/F-12 и держите ее на льду.
заметка: Храните неиспользованную среду при температуре 4 °C. Он будет использоваться для пассирования органоидов.
- Предварительно прогрейте планшеты для клеточных культур (96-луночное круглое дно) в инкубаторе при температуре 37 °С.
- Размораживание матрицы базальной мембраны (BMM) (см. Таблицу материалов) аликвоты на льду (перед началом протокола или не менее чем за 1 ч до гальванизации крипты).
заметка: BMM быстро затвердеет, если его не держать в холоде.
- Приготовьте раствор для умывания/промывки, добавив в ДПБС (ДПБС-/С) 1% раствор пенициллин-стрептомицина.
- Наполните чашку Петри диаметром 100 мм 10 мл холодного DPBS-P/S. Наполните шесть пробирок объемом 15 мл 10 мл DPBS и пометьте их от F1 до F6.
- Приготовьте 30 мл 10 мМ раствора ЭДТА путем разведения из 0,5 М ЭДТА в DPBS. Наполните две пробирки по 15 мл 10 мл 10 мл ЭДТА и пометьте их как Е1 и Е2.
- Держите все растворы предварительно охлажденными при температуре 4°C и держите их на льду во время процедуры.
2. Культура органоидов кишечника
- Пожертвуйте 8-10-недельной мышью Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) в соответствии с национальными правилами и нормами.
- Соберите 5-8 см тощей кишки, охватывающей область между двенадцатиперстной кишкой (5 см от желудка) и подвздошной кишкой (10 см от слепой кишки) и держите в холоде DPBS-P/S на льду.
- Очистите содержимое кишечника, промыв 5-10 мл холодного DPBS-P/S.
заметка: Самодельные промывочные шприцы можно получить, вставив наконечник объемом 200 мкл в насадку шприца объемом 10 мл.
- Вскрыть кишечник в продольном направлении с помощью ножниц с шариковым наконечником (см. Таблицу материалов) (для предотвращения повреждения тканей).
- С помощью щипцов перенесите ткань в чашку Петри, содержащую холодный DPBS-P/S комнатной температуры, и встряхните его для полоскания.
- С помощью пластиковой пипетки Пастера захватите кишечник путем аспирации и перенесите его в пробирку объемом 15 мл с маркировкой E1, содержащую 10 мл холодной 10 мМ ЭДТА.
- Переверните трубку 3 раза и выдерживайте на льду в течение 10 минут.
- С помощью пластиковой пипетки Пастера перенесите ткань в пробирку F1, содержащую 10 мл DPBS. Вортекс в течение 2 минут (при нормальном вихре, придерживая трубку рукой и следя за тем, чтобы кишечник хорошо закручивался).
- Поместите 10 μL фракции в чашку Петри и оцените качество фракции под микроскопом.
заметка: Все вихревые этапы выполняются с максимальной скоростью, а качество каждой фракции должно быть оценено под микроскопом (рис. 1).
- С помощью пластиковой пипетки Пастера захватите кишечник путем аспирации и перенесите его в пробирку F2, содержащую 10 мл DPBS, и переведите его в вихрь на 2 мин.
- Повторите шаг 2.10, перенеся ткань в пробирку F3, содержащую 10 мл DPBS, и вортекс на 2 минуты.
- Повторите инкубацию ЭДТА, как описано на шаге 2.6, перенеся ткань в пробирку Е2, содержащую 10 мМ ЭДТА.
- Переверните трубку 3 раза и выдерживайте на льду в течение 5 минут.
- Повторите шаг 2.10, перенеся ткань в пробирку F4, содержащую 10 мл DPBS, и вортекс на 3 минуты.
- Повторите шаг 2.14, перенеся ткань в пробирку F5, содержащую 10 мл DPBS, и вортекс на 3 мин.
- Повторите шаг 2.15, перенеся ткань в пробирку F6, содержащую 10 мл DPBS, и вортекс на 3 минуты.
- Соедините лучшие фракции, отфильтрованные под действием силы тяжести через клеточное сетчатое фильтр 70 мкм, в пробирку объемом 50 мл (на льду) для удаления ворсинок и значительного мусора.
заметка: Обычно F5 и F6 — это фракции, содержащие большое количество склепов и меньше мусора.
- Вращайте крипты при температуре 150 x g при 4 °C в течение 3 минут.
- Опорожните пробирку, разрушьте гранулу механическим способом и добавьте 5 мл холодного DMEM/F12.
- Поместите 10 μL суспензии в чашку Петри и подсчитайте количество крипт, присутствующих в аликвоте, вручную под микроскопом.
заметка: Не считайте отдельные клетки или мелкий мусор.
- Вычислите требуемый объем (V) суспензии крипт в μл, учитывая, что на одну скважину наносится 300 крипт, W — количество лунок, а N — количество крипт, отсчитанное из 10 μL суспензии. Переложите крипту в новую пробирку объемом 15 мл.
заметка: V = 300 x Ш x 10/Н. Если в планируемом эксперименте используется небольшой объем, можно использовать центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Вращайте крипту при температуре 200 x g при 4 °C в течение 3 минут.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
- Механически разрушьте гранулу и аккуратно добавьте питательную среду до получения концентрации 90 крипт/мкл.
- Добавьте 2 объема неразбавленного BMM, чтобы получить конечную концентрацию 30 крипт/мкл. Осторожно пипетируйте вверх и вниз, не вводя в смесь пузырьки воздуха.
заметка: Всегда держите трубку на льду, чтобы избежать затвердевания BMM.
- В каждой лунке налейте 10 μл крипты/BMM. Для анализа проточной цитометрии используйте 96-луночные планшеты с круглым дном. Распределите 10 μL в центре каждой лунки в виде купола.
заметка: Нанесите органоиды в виде тонкого слоя для визуализационного анализа, чтобы обеспечить их углубленную визуализацию.
- Оставьте пластину на 5 минут при температуре RT, чтобы BMM затвердел. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 на 15 минут.
- Добавьте 250 μл питательной среды в каждую лунку, стараясь не отсоединить BMM.
- Поместите пластины в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
- Проведите анализ АФК между 4 и 6 днями культивирования. В противном случае смените среду и расщепите органоиды после появления нескольких длинных почковающихся структур и когда мертвые клетки накапливаются в просветах органоидов.
3. Прохождение органоидов
- Начинать пассирование органоидов тонкого кишечника начинают с6-го дня культивирования, когда сформировались значительные почковающиеся структуры, а просветы органоидов стали темными.
заметка: Просвет органоида становится темным из-за скопления мертвых клеток, мусора и слизи. Не допускайте разрастания органоидов перед расщеплением. Коэффициент расщепления зависит от роста органоидов. Рекомендуется пропускать органоиды в соотношении 1:2 на 6-й день и 1:3 на 10-й день.
- Наполните пробирку объемом 15 мл 4 мл холодного Advanced DMEM/F-12 и держите ее на льду.
заметка: Здесь приведены объемы для 96-луночного планшета для культивирования. Если используется другой формат, отрегулируйте громкость соответствующим образом.
- Осторожно отсасывайте среду с помощью пипетки или вакуумного насоса из лунок, не касаясь куполов BMM, и выбросьте ее.
- Добавьте 100 мкл холодного Advanced DMEM/F-12 на лунку. Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы разбить BMM и перенести содержимое лунки в пробирку объемом 15 мл.
- Промойте лунку 200 мкл холодным Advanced DMEM/F-12 и соберите его в ту же пробирку.
заметка: При прохождении нескольких лунок из одних и тех же экспериментальных условий содержимое лунок может быть объединено в одной и той же сборной пробирке объемом 15 мл.
- Вращайте собирательную пробирку объемом 15 мл при 100 x g в течение 5 минут при 4°C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 1мл холодного Advanced DMEM/F-12. Используя наконечник P1000, возьмите наконечник P10 (без фильтра) и проводите пипеткой вверх и вниз не менее 20 раз.
- Добавьте в тюбик 4 мл холодного Advanced DMEM/F-12. Вращайте при 300 x g в течение 5 минут при 4°C.
- Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью пипетки или вакуумного насоса, не нарушая гранулу. Затем разрушьте гранулу механическим способом.
- Добавьте разведенный в питательной питательной среде BMM (в соотношении 2:1). Осторожно проводите пипеткой вверх и вниз, не вводя в смесь пузырьки воздуха.
- В каждой лунке налейте 10 μл крипты/BMM.
- Держите пластину в течение 5 минут при температуре RT, чтобы BMM застыл. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 на 15 минут.
- Добавьте в каждую лунку по 250 μл питательной среды.
заметка: Будьте осторожны, чтобы не отсоединить BMM.
- Поместите пластины в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
4. Получение реагентов и материалов для оценки окислительного стресса в кишечных органоидах
- Приготовьте 250 мМ стоковый раствор ингибитора N-ацетилцистеина (NAC) (см. Таблицу материалов) и повторно суспендируйте 10 мг с 245 мкл DPBS. Используйте при конечной концентрации 1 мМ.
- Приготовьте 50 мМ стоковый раствор индуктора Трет-бутилгидропероксида (тБГП), 70% в воде, и разбавьте 3,22 мкл 496,8 мкл DPBS. Используйте при конечной концентрации 200 μM.
- Для исследования методом проточной цитометрии готовят рабочий раствор флуорогенного зонда с концентрацией 250 мкМ (см. таблицу материалов), разбавляя исходный раствор на 1/10 в ДМСО. Использовать при конечной концентрации 1 мкМ.<бр/>
заметка: Как указано в инструкции производителя, флюорогенный щуп чувствителен к свету и кислороду. Акции и аликвоты не должны открываться и закрываться слишком много раз.
- Приготовьте окончательный раствор 0,1 мкг/мл DAPI в DPBS, который будет использоваться для распознавания мертвых клеток в анализе проточной цитометрии.
заметка: Эти шаги описывают использование отрицательного и положительного контроля, которые должны быть включены в любые анализы, с использованием условий, указанных на рисунке 2А. Анализ может быть использован для тестирования антиоксидантных или прооксидантных соединений. Этапы те же, и единственное различие заключается в том, когда соединения добавляются перед использованием флюорогенного красителя.
5. Количественная оценка окислительного стресса на диссоциированных органоидах с помощью проточного цитометра
- Добавьте 1 мкл стокового раствора NAC в лунки для отрицательного контроля для получения конечной концентрации 1 мМ.<бр/>
заметка: Используйте органоиды, покрытые 96-луночными пластинами с круглым дном.
- Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C и 5% CO2.
- Добавьте 1 мкл стокового раствора tBHP в соответствующие лунки для получения конечной концентрации 200 мкМ.
- Инкубировать в течение 30 минут при 37 °C и 5% CO2.
- С помощью многоканальной пипетки удалите среду, не нарушая прикрепленную BMM, и перенесите ее на другую круглую нижнюю пластину на 96 лунок. Отложите эту тарелку в сторону.
- Добавьте 100 мкл трипсина и с помощью многоканальной пипетки проводите пипеткой вверх и вниз не менее пяти раз, чтобы разрушить BMM.
- Инкубировать не более 5 мин при 37 °C и 5%CO2.
- С помощью многоканальной пипетки проводите пипеткой вверх и вниз не менее пяти раз, чтобы диссоциировать органоиды.
- Вращайте при 300 x g в течение 5 минут при RT.
- Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину. Добавьте собранную на шаге 6.3 среду обратно в соответствующие лунки и повторно суспендируйте клетки пипетированием вверх и вниз 5 раз.
- Добавьте флуорогенный зонд в конечную концентрацию 1 μМ. Добавьте 1 μЛ в лунку из разведения 250 μМ и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C и 5% CO2,
заметка: Не добавляйте флуорогенный зонд в лунки, необходимые для настройки прибора (рис. 2B).
- Вращайте при 300 x g в течение 5 минут при RT.
- Ресуспендируйте клетки 250 мкл 0,1 мкг/мл раствора DAPI. Перенесите образцы в соответствующие пробирки для проточной цитометрии, держите пробирки на льду и приступайте к анализу.
заметка: Добавьте PBS вместо DAPI в лунки, необходимые для настройки прибора (рисунок 2B).
- Оптимизируйте настройки напряжения прямого и бокового рассеяния на неокрашенных контрольных и лазерных напряжениях для каждого флуорофора с использованием образцов с одним окрашиванием.
- Используя подходящую стратегию стробирования (рис. 3A), соберите минимум 20 000 событий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтение отдается 50 000 турнирам. Подробные настройки сбора данных зависят от используемого прибора.
