Анализ SUMOylation: метод in vitro для определения статуса SUMOylation белков субстрата с помощью иммуноблоттинга

Аннотация

Источник: Yang, W. S. et al., Анализ SUMOylation in vitro для изучения активности SUMO E3 лигазы. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует метод in vitro для SUMOylation белков субстрата с использованием последовательного каскада ферментов. Кроме того, SUMOylated статус белка идентифицируется с помощью электрофореза и методики иммуноблоттинга.

Протокол

1. Приготовление конструкций экспрессии бакуловируса

1. Очистите SUMO E3 лигазу K-bZIP путем клонирования кДНК K-bZIP в вектор бакуловируса двойной экспрессии (см. Таблицу материалов) с тегом N-концевого эпитопа. Мы добились успеха при использовании октапептидной метки (обозначенной во всем протоколе как vector-tag-K-bZIP).
   заметка: Матрица ДНК для клонирования методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) K-bZIP представляет собой кДНК с обратной транскрибацией из РНК, выделенной из клеток TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 после лечения доксициклином.
   1. Перенос полноразмерной кДНК K-bZIP в вектор двойной экспрессии с помощью сайтов клонирования CpoI. Директор по маркетингуI переваривает продукт ПЦР и 1 г вектора двойной экспрессии при 37 °C в течение 3 ч.
   2. Отделите и извлеките расщепленную ДНК после электрофореза на 0,8% агарозном геле. Лигировать вставку (K-bZIP) и вектор с помощью T4 DNA ligase при 16 °C в течение 30 мин в соответствии с инструкцией производителя (см. Таблицу материалов).
   3. Добавьте 5 мкл лигирующей ДНК к 50 мкл компетентных клеток E. coli "A" (см. Таблицу материалов) в пробирку объемом 1,5 мл. Выложить на лед на 30 минут. Затем инкубируйте пробирку объемом 1,5 мл на водяной бане при температуре 42 °C в течение 45 с и сразу же положите пробирку на лед на 3 минуты.
   4. Добавьте в пробирку 600 μл среды S.O.C. (0,5% (w/v) дрожжевого экстракта, 2% (w/v) триптон, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO₄ и 4% (w/v) глюкозы) и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч. Затем центрифугируйте пробирку при комнатной температуре в течение 3 минут при 600 x g.
   5. Удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулу 60 мкл среды Лурии-Бертани (LB; 1% (w/v) триптон, 0,5% (w/v) экстракт дрожжей и 85 mM NaCl) и распределите на агаровых планшетах LB, содержащих 100 мкг/мл ампициллина. Инкубируйте агаровую пластину при температуре 37 °C в течение 16 часов.
   6. Выберите 1 колонию для посева в среду объемом 5 мл LB, содержащую 100 мкг/мл ампициллина, и культивируйте при 37 °C в течение 16 ч с встряхиванием со скоростью 250 об/мин. Затем извлеките плазмиду vector-tag-K-bZIP с помощью набора для извлечения плазмид в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
2. Сгенерируйте рекомбинантный бакмид, содержащий метку-K-bZIP, путем преобразования векторной метки-K-bZIP в компетентные клетки E. coli "B" (см. Таблицу материалов).
   1. Смешайте 0,2 мкг плазмиды vector-tag-K-bZIP и 100 мкл компетентного E. Клетки кишечной палочки «В» в пробирку объемом 1,5 мл и положить на лед на 30 мин. Инкубируйте трубку на водяной бане при температуре 42 °C в течение 45 с и сразу же поставьте трубку на лед на 3 минуты.
   2. Добавьте в пробирку 900 мкл среды S.O.C. и инкубируйте при 37 °C в течение 4 ч с вращением со скоростью 50 об/мин. Далее возьмите 10 мкл среды и добавьте еще 50 мкл среды S.O.C. для распределения по агаровым пластинам LB, содержащим 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, 100 мкг/мл субстрата галактозидазы и 40 мкг/мл изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG), и инкубировать планшеты в течение 48 ч при 37°С.
   3. Инокулируйте одну белую колонию в среду объемом 5 мкл, содержащую 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина и 10 мкг/мл тетрациклина. Инкубировать при температуре 37 °C и встряхивать со скоростью 250 об/мин в течение 16 часов.
   4. Выделите рекомбинантную ДНК бакмидов, содержащую метку-K-bZIP, количественно определите и повторно суспендируйте в концентрации 1 г/мкл.
3. Получение рекомбинантных бакуловирусов, экспрессирующих tag-K-bZIP, путем трансфекции 1 мкг рекомбинантной ДНК бакмидов, содержащей tag-K-bZIP, в клетки Sf9 в одной лунке 6-луночного планшета.
   1. Посейте 2 x 10⁶ клеток Sf9 (см. Таблицу материалов) в 2 мл среды Grace's Insect Medium, снабженной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% гентамицином, в каждой лунке 6-луночного планшета, затем инкубируйте при 27 °C в течение 1 ч.
   2. Поддерживайте логарифмическую фазу культивирования клеток Sf9 в среде Grace's Insect Medium, содержащей 10% FBS, 1% гентамицина и 1% детергента C (см. Таблицу материалов) при 27 °C в орбитальной суспензии при 140 об/мин. Подсчет клеток с помощью гемоцитометра и окрашивание трипановым синим; Жизнеспособность клеток должна превышать 95%. Поддерживайте клетки с помощью соотношения субкультивирования 1:3 каждые 2-3 дня (минимальная плотность ~0,5 x 10⁶ клеток/мл).
   3. Добавьте 2 мкл бакмидной ДНК (1 мкг/мкл) и 98 мкл восстановленной сывороточной среды (см. Таблицу материалов) в пробирку объемом 2 мкл. Затем добавьте в пробирку реагент для трансфекции объемом 4 мкл (см. Таблицу материалов) и хорошо перемешайте. Выдерживать при комнатной температуре в течение 15 минут.
   4. Добавьте эту трансфекционную смесь (104 μл) в каждую лунку и инкубируйте при 27 °C в течение 12-16 часов.
   5. Удалите отработанную среду с помощью легкой аспирации и замените 2 мл свежей среды Grace's Insect Medium, содержащей 10% FBS и 1% гентамицина. Ячейки Sf9 свободно прилегают к поверхности пластины и не нарушаются при слабой аспирации.
4. Соберите рекомбинантный бакуловирус после трансфекции и амплифицируйте бакуловирус для получения запасов с высоким титром (P1) для дальнейших экспериментов.
   1. Через 72 ч после смены среды соскоблить клетки Sf9 с помощью стерильного клеточного лифтера, собрать надосадочную жидкость из каждой отдельной лунки в пробирку объемом 1,5 мл и провести вихрь в течение 10 с.
   2. Центрифуга при 4 °C в течение 3 мин при 150 x g. Соберите надосадочную жидкость в виде P0 бакуловируса и аликвоты в 1,5 мл пробирок (по 1 мл бакуловируса в каждой пробирке). Хранить при температуре -80 °C.
   3. Посадите 1 x 10⁷ Sf9 клеток в среду Grace's Insect Medium объемом 10 мл с 10% FBS и 1% гентамицином в чашке Петри диаметром 10 см и инкубируйте при 27 °C в течение 1 часа.
   4. Для амплификации рекомбинантных бакуловирусов, экспрессирующих tag-K-bZIP, добавляют 0,5 мл P0-бакуловируса к засеянным клеткам Sf9 и инкубируют при 27 °C в течение 48 ч.
   5. Соберите надосадочную жидкость в виде бакуловируса Р1 в пробирку объемом 15 мл и храните при температуре 4 °C до 1 месяца.

2. Очистка K-bZIP

1. Поддерживайте культивирование клеток Sf9 в логарифмической фазе Grace's Insect Medium, содержащей 10% FBS, 1% гентамицин и 1% моющее средство C при температуре 27 °C в орбитальной суспензии при 140 об/мин, как описано в шаге 1.3.2.
2. В день трансдукции добавьте 1 мл содержащей бакуловирус надосадочной жидкости (P1) в 250 мл клеток Sf9 с плотностью 2 x 10⁶ клеток/мл.
3. Инкубируйте клетки Sf9 в течение 72 ч при 27 °C на орбитальном вибростенде со скоростью 140 об/мин, затем соберите центрифугированием при 2 740 x g в течение 15 мин при 4 °C.
4. Удалите гранулы надосадочной жидкости и лизических клеток в буфере для лизиса объемом 10 мл (20 мМ HEPES pH 7,9, 0,5 М NaCl, 1% детергента A (см. Таблицу материалов), 2% глицерина, коктейль ингибиторов протеазы) и вращайте со скоростью 50 об/мин с помощью смесителя суспензий при 4 °C в течение 30 минут.
5. Центрифугируйте лизат клеток при давлении 15 000 x g в течение 15 мин для сбора надосадочной жидкости.
6. Чтобы очистить tag-K-bZIP, инкубируйте лизаты клеток (10 мл) с 50 мкл магнитных шариков, помеченных антителами, в полипропиленовых пробирках объемом 14 мл и вращайте со скоростью 50 об/мин в течение 3 ч при 4 °C с помощью смесителя суспензий. После захвата белка гранулируйте шарики при центрифугировании 800 x g в течение 30 с при 4 °C. Удалите большую часть надосадочной жидкости, повторно суспендируйте шарики в остаточном объеме около 1 мл и переложите в пробирку объемом 1,5 мл для промывки.
7. Промойте захваченный белок, поместив трубку с шариками на магнитную подставку, и удалите надосадочную жидкость, как только магнитные шарики полностью прилипнут к боковой стороне трубки.
8. Промойте бусины с буфером для лизиса четыре раза.
   1. Добавьте 1 мл лизисного буфера в пробирки объемом 1,5 мл и переверните пробирки 10 раз. Поместите пробирку объемом 1,5 мл на магнитную подставку и удалите надосадочную жидкость, как описано в пункте 2.7.
   2. Повторите предыдущий шаг еще 3 раза.
9. Промойте шарики фосфатно-солевым буфером (PBS) один раз.
   1. Добавьте 1 мл PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na₂HPO₄, 1,5 мМ KH₂PO₄) в пробирки объемом 1,5 мл и переверните пробирки 10 раз.
   2. Поместите пробирку объемом 1,5 мл на магнитную подставку, а затем удалите надосадочную жидкость.
10. Элюируйте белок K-bZIP из магнитных шариков, меченных антителами, путем добавления 100 мкл 150 мкг/мл октапептида, разведенного в PBS, в пробирку объемом 1,5 мл. Вращайте трубку в течение 10 минут при 50 об/мин с помощью суспензионного смесителя при комнатной температуре. Затем поместите пробирку обратно на магнитную подставку и соберите содержащую K-bZIP надосадочную жидкость в чистую пробирку объемом 1,5 мл.
11. Проанализируйте 1-5 мкл очищенного белка tag-K-bZIP с помощью SDS-PAGE с последующим окрашиванием в синий цвет Кумасси. Загрузите 2 мкг, 1 г и 0,5 мкг образцов бычьего сывороточного альбумина (БСА) в тот же гель и используйте его для количественного определения с помощью программы обработки изображений, такой как ImageJ. Оцените концентрацию K-bZIP в сравнении со стандартами BSA.
12. Очищенный K-bZIP теперь готов к использованию в каждом анализе SUMOylation. Разбавьте K-bZIP в PBS до конечной концентрации 100 нг/мкл и храните в небольших аликвотах при -80 °C.

3. Анализ SUMOylation

1. Добавьте 3 мкл 100 нг/мкл очищенного tag-K-bZIP в мастер-смесь каждой реакции SUMOylation in vitro. Компоненты мастер-микса содержат 1 мкл белкового буфера, 1x SUMOylating buffer, 0,5 мкл белка p53 (0,5 мг/мл), 25 нМ фермента, активирующего E1 (стоковое значение: 1 мкМ), 50 нМ конъюгирующего фермента E2 (стоковое значение: 10 мкМ) и по 250 нМ каждого из пептидов SUMO (SUMO-1, SUMO-2 или SUMO-3; стоковое соединение: 5 мкМ) до конечного объема 17 мкл.
2. Осторожно перемешайте содержимое и инкубируйте реакцию при 30 °C в течение 3 ч. Остановите реакцию, добавив 20 мкл 2x загрузочного буфера SDS-PAGE (100 мМ Tris-HCL pH 6,8, 4% додецилсульфата натрия, 0,2% (масс./об.) бромфенолового синего, 20% (v/v) глицерина и 200 мМ β-меркаптоэтанола) и денатурируйте образцы при 95 °C в течение 5 минут.
3. Разделите образцы на SDS-PAGE, перенесите разделенные белки на мембрану PVDF с помощью полусухого электрофоретического передаточного аппарата и проанализируйте методом вестерн-блоттинга с использованием антитела против p53.
   1. Установите гелевый аппарат и загрузите 20 мкл образца в гелевые лунки.
   2. Запустите 10% гель при постоянном токе при напряжении 80 В в течение примерно 120 минут (пока полоса красителя не достигнет дна геля). После завершения электрофореза выключите электропитание.
   3. Отсоедините гелевый аппарат и гелевые кассеты, чтобы извлечь гель, и поместите гель в полусухой буфер для переноса (48 мМ Tris-HCl, 39 мМ глицина, 20% метанола) на 5 минут.
   4. Возьмите другую емкость и замочите мембрану PVDF в метаноле на 1 минуту. Затем извлеките ПВДФ из метанола и поместите в полусухой буфер для переноса. Аккуратно взбалтывайте мембрану в течение 5 минут.
   5. Снимите предохранительную крышку полусухого электрофоретического аппарата.
   6. Предварительно намочите фильтровальную бумагу и подготовьте гелевый сэндвич на нижнем платиновом аноде следующим образом: фильтровальная бумага, мембрана из ПВДФ, гель и фильтровальная бумага.
   7. Закрепите катодную пластину и защитную крышку, затем запустите блотку при постоянном токе 15 В в течение 90 мин. Выключите источник питания, отсоедините полусухой аппарат и извлеките мембрану из ПВДФ.
   8. Блочная мембрана из ПВДФ с блокирующим буфером (5% обезжиренного молока в буфере TBST (137 мМ NaCl2, 20 мМ Tris-HCl, 0,1% моющего средства B (см. Таблицу материалов), pH 7,6)) при комнатной температуре в течение 1 ч при встряхивании со скоростью 30 об/мин орбитальным шейкером.
   9. Гибридизовать мембрану PVDF с антителом против p53, разведенным (1:1000) в блокирующем буфере в течение 12-16 ч при 4 °C с встряхиванием со скоростью 30 об/мин с использованием смесителя суспензий.
   10. Выньте мембрану из ПВДФ в контейнер и положите в TBST. Промойте мембрану PVDF с TBST еще два раза.
   11. Замочите мембрану из ПВДФ в TBST на 30 минут с встряхиванием со скоростью 45 об/мин с помощью орбитального встряхивателя.
   12. Гибридизовать мембрану PVDF с антителом против кролика, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP), разведенной (1:4000) в блокирующем буфере в течение 1 ч при комнатной температуре с встряхиванием со скоростью 30 об/мин с использованием суспензионного смесителя.
   13. Промойте мембрану из ПВДФ с помощью TBST 3 раза, как описано в шаге 3.4.10.
   14. Замочите мембрану из ПВДФ в TBST на 30 минут с встряхиванием со скоростью 45 об/мин с помощью суспензионного смесителя. Удалите TBST и добавьте PBS, чтобы сохранить мембрану PVDF при температуре 4 °C в течение 12 часов.
   15. Смешайте реагент 1 и 2 (1:1) с усиленной хемилюминесцентной подложкой (ECL-подложкой) (см. Таблицу материалов). Снимите мембрану PVDF с PBS, кратковременно промокните бумажным полотенцем или светосъемным стеклоочистителем для впитывания лишней влаги и немедленно добавьте 400 μL реагента ECL на поверхность каждой мембраны на 3-5 минут. Удалите излишки реагента ECL путем кратковременного промокания, но не допускайте полного высыхания мембраны.
   16. Экспонируйте блот с помощью люминесцентной системы визуализации или пленки для авторадиографии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
pFastBac	Инвитроген	10359-016	Вектор бакуловируса двойной экспрессии
Вектор pCR2.1-TOPO	Инвитроген		Вектор продукта ПЦР
компетентная клетка E. coli DH5α	Дрожж Биотех	FYE678-80VL	компетентные клетки кишечной палочки А
Кишечная палочка DH10Bac	Инвитроген	10359-016	компетентные клетки E. coli B
FugeneHD	Рош	4709705001	Реагент для трансфекции
Opti-MEM	Gibco	31985062	Уменьшенное количество сывороточных сред
Т4 Лигаза	Биолаборатории Новой Англии	М0202С
CPOI (RSRII)	Термо Сайентиал	ЭР0741
Блуо-гал	Термо Сайентиал	В1690	Субстрат галактозидазы
ИПТГ	Сигма-Олдрич	И6758-1Г
Грейс Инсект Медиум	Gibco	11605094
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10082147
Гентамицин	Термо Фишер	15750060
Ампициллин	Сигма-Олдрич	А9393-25Г
канамицин	Сигма-Олдрич	К0254-20МЛ
Гентамицин	Gibco	15710-064
Тетрациклин	Сигма-Олдрич	87128-25Г
LB Бульон	Мерк	1.10285.0500
ХЕПЕС	Сигма-Олдрич	Н4034-100Г
NaCl	Сигма-Олдрич	С9888-5КГ
KCl	Мерк	1.04936.1000
Na2HPO4	Сигма-Олдрич	С5136-500Г
КХ2ГО4	Джей Ти Бейкер	3246-01
додецилсульфат натрия	Мерк	1.13760.1000
β-меркаптоэтанол	Био-Рад	161-0710 (Английский)
ТРИС (База)	Джей Ти Бейкер	4109-06
Обезжиренное молоко	Фонтерра
глицерин	Джей Ти Бейкер	2136-01
Тритон Х-100	Амреско	0694-1Л	моющее средство А
Подросток 20	Амреско	0777-500МЛ	моющее средство В
Решение Poloxamer 188	Сигма-Олдрич	П5556-100МЛ	моющее средство С
Коктейль ингибиторов протеазы в таблетках	Рош	04 693 132 001
3x Пептид Флаг	сигма	Ф4799
anti-FLAG m2 Магнитные бусины	Сигма-Олдрич	М8823	Магнитные шарики, помеченные антителами
Комплект SUMOlink SUMO-1	Активный мотив	40120	стандартный протокол SUMOylation
Комплект SUMOlink SUMO-2/3	Активный мотив	40220	стандартный протокол SUMOylation
Набор для экстракции геля QIAquick	ЦИАГЕН	No 28704
QIAGEN Plasmid Mini Kit	ЦИАГЕН	No 12123	Набор для экстракции плазмид
Полипропиленовые трубки	сокол	352059
чашка Петри	сокол	351029
Лифтер ячеек	Корнинг	CNG3008
Наконечник для погрузки	Соренсон БиоНаука	No 28480
ПВДФ	ПеркинЭлмер	NEF1002
Промокательная фильтровальная бумага	Био-Рад	1703932
Мини слэб гелевый аппарат (Bio-Rad Mini Protean II Cell)	Био-Рад	1658001 EDU
Trans-Blot SD Полусухая электрофоретическая передаточная ячейка	Био-Рад	1703940
Пирс ECL Вестерн-блоттинг	термо	No 32106	Реагент ECL
Суспензионный смеситель	Digisystem laboratory instruments Inc.	СМ-3000
орбитальный шейкер	Кансин Инструментс Ко.	ОС701
Принтер ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare	28955810
Биомолекулярный имиджер	GE Healthcare	28955810
СФ9	Термо Сайентиал	В82501
Антитела к p53	Клеточная сигнализация	#9282
антитела против кролика	GE Healthcare	НА934-1МЛ