Методическая статья

Анализ циклогексимида на основе флуоресцентных микропланшетов: метод мониторинга кинетики деградации флуоресцентных ядерных неправильно свернутых белков

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Guo, L. et. al., Анализы на деградацию неправильно свернутых белков в клетках. J. vis. Exp. (2016)

Это видео описывает микропланшетный анализ in vitro на основе флуоресценции для изучения кинетики деградации флуоресцентно меченного неправильно свернутого мутантного белка люциферазы, экспрессируемого в ядрах трансфицированных клеток млекопитающих. Анализ включает обработку клеток, экспрессирующих флуоресцентный мутантный белок, ингибитором трансляции и ингибитором протеасом, чтобы оценить опосредованную протеасом деградацию неправильно свернутого белка.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление реагента

  1. Подготовьте среду с низкой флуоресценцией DMEM для проведения анализов с помощью микропланшетного флуоресцентного ридера. Смешать 25 мМ глюкозы, 0,4 мМ глицина, 0,4 мМ аргинина, 0,2 мМ цистеина, 4,0 мМ глутамина, 0,2 мМ гистидина, 0,8 мМ изолейцина, 0,8 мМ лейцина, 0,8 мМ лизина, 0,2 мМ метионина, 0,4 мМ фенилаланина, 0,4 мМ серина, 0,8 мМ треонина, 0,078 мМ триптофана, 0,4 мМ тирозина, 0,8 мМ валина, 1,8 мМ CaCl2, 0,81 мМ MgSO4, 5,33 мМ KCl, 44,0 мМ NaHCO3, 110 мМ NaCl, 0,9 мМ2PO4. Отрегулируйте pH раствора с помощью HCl или NaOH до pH 7,4. Стерилизуйте среду с помощью фильтрации.
    заметка: Эта среда содержит компоненты стандартной среды DMEM с высоким содержанием глюкозы, за исключением Fe(NO3)3, витаминов и фенолового красного. Фенол Ред, рибофлавин и пиридоксаль в обычной культуральной среде DMEM значительно препятствуют детектированию флуоресцентного сигнала. Питательная среда без этих компонентов имеет решающее значение для успешной визуализации GFP живых клеток. Среда стабильна в течение 12 месяцев при хранении в холодильнике.

2. Анализ деградации NLS-люциферазы-GFP в реальном времени с использованием флуоресцентного микропланшетного ридера

  1. Засейте примерно 1 x 104 клетки HeLa в черные 96-луночные планшеты для культивирования тканей с прозрачным дном. После культивирования O/N достигается конфлюенция 50-70% в момент трансфекции.
    Примечание: 60 мкл среды, содержащей полностью взвешенные клетки HeLa, засеваются непосредственно в каждую лунку. Не добавляйте дополнительную среду или каменную плиту туда-сюда после посева, иначе ячейки могут распределиться неравномерно.
  2. Трансфицируйте клетки HeLa 0,05-0,1 мкг плазмиды NLS-люциферазы-GFP/pRK5 в каждую лунку с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкцией производителя. Изготовьте мастер-трансфекционную смесь, содержащую ДНК и трансфекционный реагент, и распределите ее по каждой лунке. Три лунки с клетками не трансфицируются ДНК, которая служит контролем для сигнала фоновой флуоресценции для каждого условия лечения.
    заметка: Альтернативным способом снижения трансфекционной изменчивости является трансфекция клеток перед посевом. Тем не менее, большая часть клеток, трансфицированных неправильно свернутыми белками, не может прикрепиться или демонстрирует сниженную жизнеспособность при использовании этого метода. Вполне вероятно, что некоторые клетки могут не выдерживать стресса, вызванного перевариванием трипсина при экспрессии токсичных неправильно свернутых белков. В результате общий флуоресцентный сигнал значительно снижается.
  3. Через 20-24 ч после трансфекции исследовать живые клетки под инвертированным флуоресцентным микроскопом на экспрессию GFP с длиной волны возбуждения 450-490 нм.
  4. Удалите среду с помощью вакуумной аспирации. Добавьте примерно 200 мкл 1x PBS в каждую лунку, а затем отсасывайте его, чтобы удалить остаточное количество среды DMEM.
  5. Добавьте 60 мкл низкофлуоресцентной среды DMEM с 5% FBS и 50 мкг/мл CHX. Для изучения протеасомной деградации включите дополнительный ингибитор протеасом MG132 (10 мкМ) в один набор образцов. Установите тройное количество лунок для каждого лечения/состояния.
    заметка: Лечение MG132 включено в качестве контроля протеасомной деградации, поскольку крайне важно исключить другие факторы, которые могут вызвать падение флуоресцентного сигнала, включая гибель клеток и гашение флуоресценции.
  6. Немедленно измерьте флуоресцентный сигнал GFP на люминесцентном считывателе после добавления CHX.
    заметка: Настройки программного обеспечения для измерения приведены в таблице 1.
  7. Читайте табличку каждый час в течение 8-10 часов. После прочтения верните планшет обратно в инкубатор для клеточных культур.
  8. Экспортируйте данные в виде файла электронной таблицы. Используйте среднее значение многократных считываний для каждой лунки, а также интенсивность флуоресценции. Нормализуйте значения каждой точки данных до средних значений времени 0 в соответствующих группах. Построите график нормированной интенсивности флуоресценции во времени, как показано на рисунках 1A и 1B, а также на рисунке 2, правые панели.
  9. Выполнение статистического анализа скоростей деградации между двумя условиями с использованием двустороннего ANOVA с повторными измерениями.
    заметка: В этом анализе «интенсивность флуоресценции» является зависимой переменной, в то время как «условия лечения» и «время» являются двумя факторами. Вместо сравнения данных в отдельных временных точках, двусторонняя ANOVA с повторными измерениями анализирует разницу между двумя группами лечения на протяжении всего временного цикла.

Таблица 1: Настройки измерений на флуоресцентном считывателе микропланшетов.

Файл определения пластиныGRE96fb
Режим измеренияИнтенсивность флуоресценции снизу
Длина волныДлина волны возбуждения485 нм
Ширина полосы возбуждения9 нм
Длина волны излучения535 нм
Ширина полосы излучения20 нм
Количество вспышек5
УсилениеРучная 200
Время интеграции20 мкс
Несколько прочтений на лункутипКруг (закрашенный)
размер5×5
граница400 мкм

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Анализ на основе флуоресцентных микропланшетов для деградации NLS-LucDM-GFP. Клетки HeLa, высеянные на 96 луночных планшетах, трансфицировали 0,05 мкг (A) или 0,1 мкг (B) NLS-LucDM-GFP и обрабатывали CHX в присутствии или отсутствии MG132. (А и В) Интенсивности флуоресценции скважин измеряли в указанные моменты времени (ср...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Модифицированный Eagle Medium от DulbeccoТехнологии Life11995-092
Фетальная бычья сывороткаТехнологии Life10082147
Липофектамин 2000Технологии Life11668019
МГ132Сигма-ОлдричМ8699
аминокислотыСигма-ОлдричАминокислоты используются для изготовления культуральной среды с низкой флуоресценцией
ЦиклогексимидСигма-ОлдричС7698
Olympus IX-81 Инвертированный флуоресцентный микроскопОлимпIX71/IX81
96 Well Черная тарелка TC с полупрозрачным прозрачным дномСигма-Грайнер89135-048
Флуоресцентный считыватель нижней пластины Infinite 200® PROТЕКАНБесконечное 200® PRO
Призма 5ГрафПадПрограммное обеспечение для статистического анализа

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SUMOHeLa

Похожие статьи