Анализ нейтрализующих антител AAV на основе клеток: колориметрический метод обнаружения нейтрализующих антител против специфических аденоассоциированных вирусов в сыворотке крови

Аннотация

Источник: Bass-Stringer, S., et al. Пошаговый метод обнаружения нейтрализующих антител против AAV с помощью колориметрического клеточного анализа. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео мы демонстрируем колориметрический анализ in vitro для обнаружения присутствия нейтрализующих антител против векторов щелочной фосфатазы, экспрессирующего рекомбинантный аденоассоциированный вирус серотипа 6 (rAAV6) в образцах сыворотки крови овец. В анализе используется реакция между AAV, кодирующим ген плацентарной щелочной фосфатазы человека, и его субстратом для получения нерастворимого фиолетового продукта.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

Схематический обзор протокола анализа представлен на рисунке 1.

1. Начальная подготовка

1. Для оценки у овец: соберите кровь в 8 мл пробирок-активаторов сгустка сыворотки крови (см. Таблицу материалов), оставьте образец крови при комнатной температуре (RT) на 20-30 минут, а затем уменьшите при 2100 x g в течение 15 минут. Прозрачная надосадочная жидкость, которая образуется в верхней части трубок, является сывороткой. Аликвотируйте прозрачную водную фазу в микроцентрифужные пробирки и храните при температуре -80 °C.
   заметка: Сыворотка при -80 °C остается стабильной в течение ~5 лет. Кровь собирали из сонной вены с помощью иглы 16 G (отрезанный кончик) и шприца у животных, находящихся в сознании.
2. Нагрейте инактивированную фетальную бычью сыворотку (FBS), поместив ее на водяную баню при температуре 56 °C на 30 минут, и периодически взмешивайте. Для точности поместите термометр во вторую бутылку, содержащую эквивалентный объем воды, и добавьте ее в горячую баню одновременно с бутылкой FBS. Начните отсчитывание времени, когда столбик термометра достигнет 56 °C.
3. Используйте надлежащую асептическую технику и практику культивирования клеток для всех последующих этапов, выполняемых в колпаке для клеточных культур. Распылите 70% этанол на все предметы и вытяжку перед использованием и очистите 1% гипохлоритом натрия по завершении.
4. Приготовьте полноценную модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), сочетая высокое содержание глюкозы (4,5 г/л) DMEM (89%) с инактивированным при нагревании FBS (10%) и пенициллин стрептомицином (1%). Объедините и отфильтруйте с помощью стерильной системы вакуумной фильтрации (размер пор 0,22 мкм, мембрана из полиэфирсульфона) (см. Таблицу материалов). Хранить полностью завернутый в фольгу DMEM при температуре 4 °C.
5. Установите ячейки HT1080 (см. Таблицу материалов) и пройдите в колбе площадью^{75 см 2} квадрата. Создайте несколько замороженных запасов ячеек. Не используйте клетки после 20 пассажей, так как дальнейшее пассирование может повлиять на результаты анализа.

2. День 1 - Покрытие клеток

1. Проходите клетки HT1080, когда они достигают ~80% конфлюенции.
2. Предварительно нагрейте полный DMEM (приготовленный на шаге 1.4), 0,05% трипсин-ЭДТА и 1x фосфат-буферный физиологический раствор (PBS) до 37 °C на водяной бане. Удалите питательную среду из пассаженных клеток с помощью аспирационной системы.
   заметка: Для всех аспираций в этом протоколе используется вакуумная система с трубкой, прикрепленной к стерильной серологической пипетке объемом 5 мл.
3. Промойте клетки в 10 мл предварительно подогретого (37 °C) 1x PBS и трипсинизируйте клетки в течение 3-4 минут в 4 мл предварительно подогретого 0,05% трипсина-ЭДТА, чтобы отделить клетки от колбы.
4. Инактивируйте трипсин, добавив 6 мл предварительно подогретого полного DMEM, и пипетируйте клетки в пробирку объемом 50 мл. Рассчитайте количество и концентрацию жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра и метода исключения трипанового синего.
5. Разбавьте клетки до концентрации 1 x 10⁵ клеток/мл в предварительно нагретом полном DMEM. Засейте 100 мкл клеток/лунку в прозрачные 96-луночные плоскодонные планшеты (1 x 10^{по 4} клетки на лунку). Инкубируйте планшет при 37 °C, 5% углекислом газе (CO₂) в течение ночи в течение 16-22 часов.

3. День 2 - Заражение клеток

1. Извлеките планшет (пластины) из инкубатора и с помощью светового микроскопа убедитесь, что клетки равномерно распределены по лункам и что сливаемость составляет ~50%. Если конфлюентность клеток не находится в диапазоне 45%-55%, повторите протокол «День 1» и соответствующим образом отрегулируйте исходную концентрацию клеток.
2. Получение последовательных разведений образцов сыворотки в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл с использованием предварительно подогретого полного DMEM в качестве разбавителя. В таблице 1 показана генерация каскада разрежения для тройных проб.
   1. Для проведения анализа в трех экземплярах необходимо получить 7,5 x 10⁶ векторных геномов (vg)/мкл рабочего раствора AAV6-hPLAP (см. Таблицу материалов) путем разбавления исходного раствора вируса в 1x PBS.
   2. Добавьте 66 μL рабочего раствора вируса 7,5 x 10⁶ vg/μL в каждую пробирку, содержащую 264 μL разбавления сыворотки/среды (330 μL от общего объема/разведения, см. Таблицу 1).
      заметка: Это надежный анализ, который не требует идеальных условий для культивирования. Однако для точной количественной оценки и обеспечения надежности каждого прогона анализа необходимо включить следующее: (1) контроль только на вирус и среду, (2) контроль только на среде и (3) положительный контрольный образец NAb на всех планшетах в одинаковых экспериментальных условиях. Описываемый объем (330 мкл) включает в себя тройные образцы + 10% смеси сыворотки и вируса. Выполнение повторов настоятельно рекомендуется для точного определения нейтрализующей активности.
3. Смешайте разведения вируса/сыворотки с помощью пипетирования и поместите пробирки, содержащие смеси вируса/сыворотки, в инкубатор при температуре 37 °C, 5%_CO2 на 30 минут, чтобы обеспечить потенциальную нейтрализацию.
4. Пипеткой подайте 100 мкл смеси вирус/сыворотка в каждую лунку на 96-луночном планшете, содержащем 1 x 10⁴ клетки/лунки для каждого разведения.
   заметка: Это приведет к получению окончательной концентрации вируса в 15 тыс. вирусов на одну клетку инфекции (MOI) в каждой скважине. В таблице 2 приведена примерная схема расположения 96-луночных пробоотборных планшетов для оценки проб до разведения 1/512.
5. Оберните 96-луночный планшет, содержащий клетки, сыворотку и AAV-hPLAP, в фольгу и поместите в инкубатор при температуре 37 °C, 5%_CO2 на ночь на 16-24 часа, чтобы обеспечить поступление AAV в клетки.

4. День 3 - Закрепление и добавление субстрата в клетки

1. Предварительно нагрейте аликвоту 1x PBS до 37 °C (~25 мл/96-луночный планшет). Охладите отдельные аликвоты PBS (~25 мл/96-луночный планшет) и дважды дистиллированного H₂O (DDW, ~25 мл/96-луночный планшет) до 4 °C. Растворите гранулу BCIP/NBT (см. Таблицу материалов) в 10 мл DDW в конической центрифужной пробирке объемом 50 мл методом вортексования (10 мл достаточно для 2 x 96-луночных планшетов).
2. Отсасывайте среду из лунок 96-луночного планшета с помощью серологической пипетки или аналогичной пипетки, прикрепленной к аспирационной системе на основе аспирации или вакуумному вытяжному шкафу. Осторожно поместите кончик серологической пипетки в лунку и удалите среду, стараясь не нарушить прилипшие клетки.
   1. Добавьте 50 μL RT 4% PFA в каждую лунку с помощью пипетки. Заверните пластину в фольгу и оставьте в режиме RT на 10 минут для фиксации ячеек.
      осторожность: Параформальдегид (PFA) является вероятным канцерогеном и токсичен при попадании на кожу или в глаза, а также при вдыхании. Ручка в вытяжном шкафу с надлежащими средствами индивидуальной защиты, а также в маске для лица. Приготовьте свежий 4% PFA, разведенный в PBS (~7 мл требуется на 96-луночный планшет).
3. Промойте и аспирируйте клетки 200 μл RT 1x PBS. Повторите этот шаг дважды.
   заметка: Многоканальный пипетка является эффективным вариантом для этапов пипетирования.
4. Внесите пипетку по 200 мкл предварительно подогретого PBS в каждую лунку, оберните планшет фольгой и инкубируйте при температуре 65 °C в течение 90 минут, чтобы денатурировать активность эндогенной щелочной фосфатазы.
5. Отсадите лунки и промойте ячейки 200 μл холодного (4 °C) PBS. Снова отасывайте, промойте в 200 μл холодного DDW, и снова аспирируйте.
6. Внесите пипеткой по 50 мкл растворенного BCIP/NBT (приготовленного на шаге 4.1) в каждую лунку.
7. Заверните тарелку в фольгу и выдерживайте при RT в течение 2-24 ч.<бр/> заметка: Соблюдайте время инкубации между запусками; Гибкость времени позволяет пользователям фотографировать скважины как на 3-й день, так и на следующий день.
8. Используя камеру светового микроскопа, сделайте фотографии каждой лунки с помощью объектива с 4-кратным увеличением, гарантируя, что для всех проведенных анализов одинаково используется одна и та же экспозиция, баланс белого и настройки освещения.
   1. Расположите каждую лунку одинаково и убедитесь, что края лунки не видны на фотографиях. Сохраняйте фотографии в формате TIF или аналогичном.
      заметка: Конкретные настройки будут варьироваться в зависимости от микроскопа, но количественное определение будет наиболее эффективным, если фоновое освещение будет высоким и постоянным во всех лунках (рис. 1B).

Таблица 1: Объемы сыворотки и разбавителя, необходимые для получения серийных разведений сыворотки в трех экземплярах.

Каскадная этикетка разбавления	разбавление	3 образца (240 μл) + 10% объема буфера (24 μл)	Соотношение сыворотки:медиа
Разбавление 1 (D1)	1/2	264 мкл сыворотки 264 мкл сред	50:50
Разведение 2 (D2)	1/4	264 мкл D1 + 264 мкл среды	25:75
Разбавление 3 (D3)	1/8	264 мкл D2 +264 мкл среды	12.5:87.5
Разведение 4 (D4)	1/16	264 мкл D3 +264 мкл среды	6.25:93.75
Разбавление 5 (D5)	1/32	264 мкл D4 +264 мкл среды	3.13:96.87 (Английский)
Разведение 6 (D6)	1/64	264 мкл D5 +264 мкл среды	1.56:98.44
Разведение 7 (D7)	1/128	264 мкл D5 +264 мкл среды	0.78:99.22
Разбавление 8 (D8)	1/256	264 мкл D5 +264 мкл среды	0.39:99.61
Разведение 9 (D9)	1/512	264 мкл D7 + 264 мкл среды	0.2:99.8
Разведение 10 (D10)	1/2048	132 мкл D8 + 396 мкл среды	0.05:99.95
Разведение 11 (D11)	1/8192	132 мкл D9 + 396 мкл среды	0.01:99.99
Разведение 12 (D12)	1/32768	132 мкл D10 + 396 мкл среды	0.003:99.997

Таблица 2: Пример 96-луночного планшета для оценки наивных образцов сыворотки в разведениях от 1/2 до 1/512. Более высокие разведения включаются в анализ при оценке образца, заведомо положительного на AAV NAbs (образцы после введения) или если требуется более высокий титр. MO (-C): Управление только носителем. VO (+C): Контроль только вирусов и носителей. mAb: Моноклональное антитело против AAV (NAb положительный контроль).

образец сыворотки #1

Образец сыворотки #2

образец сыворотки #3

Mono AB (mAB), элементы управления и дополнительные сэмплы

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

50 ng МАб

50 ng МАб

50 ng МАб

B

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

5 ng МАб

5 ng МАб

5 ng МАб

C

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

0.5 ng МАб

0.5 ng МАб

0.5 ng МАб

D

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

MO (-C)

MO (-C)

MO (-C)

E

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

VO (+C)

VO (+C)

VO (+C)

F

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

Sample #1<брат /> 1/512

Sample #1<брат /> 1/512

Sample #1<брат /> 1/512

G

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

Sample #2<бр /> 1/512

Sample #2<бр /> 1/512

Sample #2<бр /> 1/512

H

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

Sample #3<брат /> 1/512

Sample #3<брат /> 1/512

Sample >#3 1/512

Результаты

Рисунок 1: Принципиальная схема протокола анализа NAb. (A) Визуальное представление анализа NAb, иллюстрирующее основные этапы, связанные с трехдневным протоколом. Вкратце, клетки выращиваются и покрываются в течение ночи. На следующий день готовят серийные разведения сыворотки, инкубируют с AAV, а затем инкубируют с клетками в течение ночи. На следующий день клетки фиксируются, промываются, инкубиру...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,05% трипсин/ЭДТА	Gibco	No 25300-054
Коническая центрифужная пробирка объемом 50 мл	сокол	Телефонный номер 14-432-22	Или эквивалент
75 см2 квадратных колбы	сокол	353136	Или эквивалент
96 хорошо плоскодонная тарелка	сокол	353072
Вектор AAV6-CMV-hPLAP			Muscle Research & Therapeutics Lab (Мельбурнский университет, Австралия) AAV6-CMV-hPLAP может быть предоставлен по запросу.
Алюминиевая фольга
Мышиное моноклональное антитело против AAV6 (интактных частиц), (ADK6)	ПРОГЕН	610159	Моноклональные антитела положительного контроля
BCIP/NBT	СИГМАСТ	В5655
Шкаф безопасности для клеточных и тканевых культур
Электронная пипетка			Полосатые вставки объемом 5 и 10 мл
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10099-141
Гемоцитометр
Модифицированная орлиная среда Дульбекко с высоким содержанием глюкозы (DMEM)	Gibco	11965118
Элементы HT1080	АТКС
инкубатор			37 °C, 5%CO2
Световой микроскоп с камерой			Возможность съемки с 4-кратным объективом
печь			Для инкубации при температуре 65 °C
Параформальдегид	Мерк	30525-89-4 (Английский)
Водяная баня
Пенициллин стрептомицин	Gibco	15140-122