$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Приготовление питательной среды, раствора офлоксацина и клеток E. coli
- Обычная среда Лурии-Бертани (LB): добавьте 10 г/л триптона, 10 г/л хлорида натрия (NaCl) и 5 г/л дрожжевого экстракта в деионизированную (DI) воду. Стерилизуйте среду путем автоклавирования.
- Пластины с агаром LB: Добавьте 10 г/л триптона, 10 г/л NaCl, 5 г/л дрожжевого экстракта и 15 г/л агара в воду DI и простерилизуйте среду путем автоклавирования. При нужной температуре (~55 °C) насыпьте ~30 мл агаровой среды в квадратные пластины (10 х 10 см). Высушите тарелки и храните их при температуре 4 °C.
- Модифицированная среда LB: Добавьте 10 г/л триптона и 5 г/л дрожжевого экстракта в воду DI. Стерилизуйте среду путем автоклавирования.
- Модифицированная среда LB, включая осмолит: Смешайте 2x модифицированную среду LB с 2x раствором осмолита в равных объемах. Чтобы приготовить 2x модифицированную среду LB, добавьте 20 г/л триптона и 10 г/л дрожжевого экстракта в воду DI и стерилизуйте автоклавированием. Чтобы приготовить 2x раствор осмолита, растворите интересующий вас осмолит (2x количество) в деионизированной воде, а затем отфильтруйте стерилизованный раствор.
заметка: Представляющий интерес осмолит и его концентрации могут быть определены с помощью скрининговых анализов Phenotype Microarray (см. Протокол 4). Тем не менее, испытуемый осмолит и связанная с ним 2-кратная концентрация могут быть скорректированы в зависимости от характера исследования. Например, для изучения воздействия 1 мМ хлорида натрия 2-кратный раствор осмолита будет представлять собой 2 мМ раствор хлорида натрия.
- Стоковый раствор офлоксацина (5 мг/мл): Добавьте 5 мг соли офлоксацина (OFX) в 1 мл деионизированной воды. Добавьте 10 мкл 10 мкл гидроксида натрия 10 М для повышения растворимости OFX в воде, а затем отфильтруйте стерилизующий раствор. Подготовьте аликвоты и храните при температуре -20 °C.<бр/>
заметка: Офлоксацин является хинолоновым антибиотиком, который широко используется как для растущих, так и для нерастущих бактериальных клеток14,21. Минимальная ингибирующая концентрация (MIC) OFX для клеток E. coli MG1655 находится в диапазоне 0,039–0,078 мкг/мл. Кроме того, обратите внимание, что другие антибиотики, такие как ампициллин и канамицин, обычно используются в настойчивых исследованиях. Выбор антибиотиков зависит от характера исследования.
- Клеточные запасы E. coli MG1655: Инокулируйте 2 мл обычной среды LB с одной колонией в пробирку объемом 14 мл (с защелкивающейся крышкой) и культивируйте клетки в орбитальном шейкере при 250 об/мин и 37 °C. Когда клетки достигнут стационарной фазы, смешайте 500 мкл клеточной культуры с 500 мкл 50% глицерина (стерильного) в криогенном флаконе и храните при температуре -80 °C.
2. Размножение клеток для уничтожения ранее существовавших персистентов
- Чтобы приготовить ночную культуру, соскребите небольшое количество клеток из замороженного клеточного материала с помощью стерильного наконечника пипетки (не размораживайте глицериновый клеточный материал) и инокулируйте клетки в 2 мл модифицированной среды LB в пробирку объемом 14 мл с защелкивающейся крышкой. Культивируйте клетки в орбитальном вибростенде при 250 об/мин и 37 °C в течение 12 часов.
- Первое размножение
- Через 12 ч перенесите 250 мкл ночной культуры в 25 мл свежей модифицированной среды LB в колбу объемом 250 мл, покрытую стерильной алюминиевой фольгой.
- Выращивайте клеточную культуру в орбитальном шейкере при 250 об/мин и 37 °C до тех пор, пока клетки не достигнут среднеэкспоненциальной фазы (OD600 = 0,5).
- Измеряйте оптическую плотность на длине волны 600 нм (наружный диаметр600) с помощью считывателя микропланшетов каждые 30 минут.
- Второе распространение
- При наружном диаметре600 = 0,5 развести 250 мкл клеточной культуры из первой колбы в 25 мл свежей модифицированной среды LB в колбе объемом 250 мл.
- Выращивайте вторую клеточную культуру в орбитальном вибростенде при 250 об/мин и 37 °C до наружного диаметра600=0,5.
- Измеряйте оптическую плотность каждые 30 мин.<бр/>
заметка: Культура, созданная на ночь, может содержать значительное количество персистентных клеток. Описанный выше метод цикла разведения/роста может быть использован для устранения этих ранее существовавших персистентов перед переносом клеток в микрочипы. Их элиминация может быть подтверждена путем количественного определения стойких уровней ночных культур с помощью анализа, описанного в Протоколе 3.
3. Валидация устранения ранее существовавших персистентных клеток
- После второго размножения (см. шаг 2.3) разведите 250 мкл клеточной культуры (наружный диаметр600 = 0,5) в 25 мл свежей модифицированной среды LB в колбе объемом 250 мл><.
заметка: Для контроля разведите 250 мкл ночного посева (см. шаг 2.1) в 25 мл свежей модифицированной среды LB в колбе объемом 250 мл. Перед переносом клеток в колбу плотность клеток ночной культуры следует регулировать в свежей модифицированной среде LB для получения OD600 = 0,5.
- Добавьте 25 мкл стокового раствора OFX (5 мг/мл) в клеточную суспензию и осторожно встряхните колбу, чтобы сделать культуру анализа однородной. Конечная концентрация OFX составляет 5 мкг/мл в анализируемой культуре.
- Инкубируйте пробирную культуру в орбитальном вибростенде при 250 об/мин и 37 °C.
- Каждый час во время обработки (включая 0 ч, момент времени перед добавлением OFX в культуру анализа) переливайте 1 мл культуры анализа из колбы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Центрифугируйте культуру для анализа в микроцентрифужной пробирке при давлении 17 000 x g в течение 3 минут.
- Осторожно удалите 950 мкл надосадочной жидкости, не повреждая клеточную гранулу.
- Добавьте 950 μл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) в микроцентрифужную пробирку.
- Повторяйте шаги промывки 3,5-3,7 в общей сложности 3 раза, пока концентрация антибиотика не опустится ниже минимальной ингибирующей концентрации (MIC).
- После окончательной промывки повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 μл раствора PBS, в результате чего получится 10-кратный концентрированный образец.
- Возьмите 10 μL клеточной суспензии и последовательно разведите ее шесть раз в 90 μL раствора PBS с помощью 96-луночной круглой нижней пластины.
- Нанесите 10 мкл разбавленных клеточных суспензий на свежие агаровые планшеты без антибиотиков. Чтобы увеличить предел обнаружения, нанесите оставшиеся 90 мкл клеточной суспензии на свежую агаровую пластину.
- Инкубируйте агаровые пластины при 37 °C в течение 16 ч, а затем подсчитайте колониеобразующие единицы (КОЕ). Учитывайте нормы разбавления при расчете общего количества КОЕ в 1 мл анализируемой культуры. Кривые уничтожения строятся путем построения логарифмических значений КОЕ в зависимости от продолжительности лечения антибиотиками.
заметка: Для получения двухфазной кривой уничтожения клеток E. coli достаточно 6-часовой обработки OFX. Уровень персистенции размножаемых клеток (измеряемый с помощью подсчета КОЕ через 6 ч) должен быть значительно меньше, чем у ночной культуры. Процедуры, описанные в Протоколах 2 и 3, могут быть выполнены с обычным LB в зависимости от дизайна исследования.
4. Отсеивание микрочиповых пластин
- Получение микрочип-клеточных культур
- Перенесите 250 мкл экспоненциально-фазовых клеток в 25 мл свежей модифицированной среды LB в центрифужной пробирке объемом 50 мл. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию, чтобы сделать ее однородной.
заметка: Экспоненциально-фазовые ячейки (OD600 = 0,5) получают на втором этапе распространения (см. шаг 2.3).
- Перелейте разведенную клеточную суспензию в стерильный резервуар объемом 50 мл.
- С помощью многоканальной пипетки переносят 150 мкл клеточной суспензии в каждую лунку микрочипа, т.е. в 96-луночный планшет, содержащий различные осмолиты.
заметка: В качестве контрольных служат скважины, в которых нет осмолитов.
- Накройте микрочип газопроницаемой уплотнительной мембраной.
- Инкубируйте планшет в орбитальном вибростенде при температуре 37 °C и 250 об/мин в течение 24 ч.<бр/>
заметка: В этих экспериментах использовались коммерчески доступные планшеты, такие как микрочипы фенотипа (PM-9 и PM-10), которые включают широкий спектр осмолитов, буферов pH и других химических веществ в высушенном состоянии в различных концентрациях. Эти микрочипы имеют половину площади 96 луночных планшетов. Объемы культур следует корректировать в зависимости от типа используемых планшетов. Микрочипы также могут быть сгенерированы вручную.
- Ручная подготовка микрочиповых пластин
- Перелейте 75 μл 2x растворов осмолита в лунки половины площади 96 луночного планшета.
- Перенесите 500 μL экспоненциально-фазовых клеток в 25 мл 2x модифицированной LB-среды в центрифужной пробирке объемом 50 мл. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию, чтобы сделать ее однородной.
заметка: Скорость инокуляции была скорректирована в соответствии с протоколом скрининга микрочипов, описанным в 4.1.
- Добавьте 75 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета половинной площади, содержащего 2x раствора осмолита.
- Инкубируйте планшет в орбитальном вибростенде при температуре 37 °C и 250 об/мин в течение 24 часов.
- Подготовка пластин для стойкого анализа
- Приготовьте 25 мл модифицированной среды LB, содержащей 5 мкг/мл OFX, в центрифужной пробирке объемом 50 мл и перенесите эту среду в стерильный резервуар.
- Перекачайте 190 мкл модифицированной среды LB с OFX из резервуара в каждую лунку типовой плоскодонной 96-луночной пластины (планшет для персистентного анализа) с помощью многоканальной пипетки.
- Извлеките микрочип из шейкера (после культивирования в течение 24 ч) и перенесите 10 мкл клеточных культур из микрочипа в лунки планшета для персистентного анализа, содержащего модифицированную среду LB с OFX.
- Возьмите 10 мкл клеточных суспензий из планшета для персистентного анализа и последовательно разбавьте три раза в 290 мкл раствора PBS с помощью 96-луночного планшета с круглым дном и многоканальной пипетки.
- После серийного разведения с помощью многоканальной пипетки обнаружить 10 мкл всех серийно разведенных клеточных суспензий на свежих агаровых планшетах, не содержащих антибиотиков.
- Планшет для стойкого анализа (подготовленный на стадии 4.3.3) инкубируют в орбитальном вибростенде при температуре 37 °C и 250 об/мин в течение 6 ч после покрытия планшета газопроницаемой герметизирующей мембраной.
- После 6 ч инкубации в шейкере выньте планшет для стойкого анализа и повторите шаги 4.3.4-4.3.5.
- Инкубируйте агаровые пластины в течение 16 ч при 37 °C, а затем подсчитайте КОЕ. Уровни КОЕ до и через 6 ч после лечения антибиотиками позволяют рассчитать персистирующую фракцию в каждой скважине. Подсчет КОЕ до обработки OFX также помогает оценить влияние осмолитов и на жизнеспособность E. coli.