1. Измерение снижения протеостаза в мышечной ткани с помощью животных, экспрессирующих полиглутамин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения снижения протеостаза в мышечных клетках можно использовать два метода: визуализация образования белковых агрегатов во время старения (1.1) и измерение протеотоксичности, которую эти агрегаты вызывают с возрастом до наступления паралича (1.2).
- Визуализация образования полиглутаминовых агрегатов в мышцах при старении
заметка: Возрастное прогрессирование агрегации белков в мышечных клетках визуализируется с помощью полиглутаминовых (polyQ) повторов, слитых с желтым флуоресцентным белком (YFP). В этом протоколе описывается использование штамма AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP], но также могут быть использованы другие штаммы полиглутаминового варианта. Трансген polyQ::YFP экспрессируется в мышце с помощью мышечно-специфического промотора unc-54. Синхронизированные животные, экспрессирующие unc-54p::p olyQ::YFP, визуализируются в 1, 2, 3 и 4 день взрослой жизни. Для визуализации агрегатов unc-54p::p olyQ::YFP используйте составной микроскоп, предназначенный для флуоресценции, или флуоресцентный препарирующий микроскоп. AM140 можно приобрести в Центре генетики Caenorhabditis (CGC) по адресу: https://cgc.umn.edu/strain/AM140
- В дни визуализации (1, 2, 3 и 4 день взрослого возраста) выберите 20 животных и установите их на предметное стекло микроскопа с 3% агарозной прокладкой и каплей 5 мкл 10 мМ азида натрия (разведенного в буфере M9).
- После того, как все животные будут обездвижены азидом натрия (~ 5 минут), сфотографируйте все тела животных с помощью линзы с 10-кратным увеличением (рис. 1А). Для визуализации используйте фильтр FITC и одинаковую экспозицию для каждого животного. Отбросить слайды после создания изображения.
заметка: В качестве альтернативы, очаги YFP также могут быть количественно определены непосредственно на пластинах, но движение должно быть подавлено путем подачи потока углекислого газа на пластину во время биговки. Этот альтернативный метод наиболее целесообразен при скрининге большого количества состояний.
- После получения снимков подсчитайте количество очагов в мышцах стенки тела всего животного. Фокусы — это более яркие пунктуированные сигналы, которые можно отличить от более тусклого растворимого сигнала на заднем плане.
- Составьте график последовательности накопления очагов YFP с 1, 2, 3 и 4 дней. Постройте график XY, где X представляет дни взрослой жизни, а Y представляет количество фокусов unc-54p::p olyQ::YFP (рис. 1B). Количество очагов в экспериментальных условиях (например, подавление или гиперэкспрессия генов) сравнивают с контрольными животными. Проведите статистический анализ между группами в каждый момент времени, наблюдаемый для каждого испытания.
- При сравнении количества фокусов только для двух условий выполняйте независимый выборочный t-критерий в каждой временной точке.
- При сравнении количества фокусов для более чем двух условий выполните омнибусный односторонний анализ ANOVA для каждой временной точки, включая данные для всех условий в этой временной точке. Если омнибусный ANOVA дает значимое p-значение (т. е. p < 0,005), проведите апостериорный анализ с помощью попарно независимых выборочных t-тестов, чтобы определить конкретные условия, между которыми была обнаружена значимая разница в очагах (например, для групп A, B и C сравните A & B, A & C, B & C).
2. Измерение частоты паралича животных в качестве суррогата токсичности полиглутамина в мышечных клетках
ПРИМЕЧАНИЕ: Возрастное увеличение агрегатов polyQ в мышцах вызывает снижение мышечной функции, которая управляет локомоцией. Этот дефект в передвижении может быть определен путем измерения прогрессирующей скорости паралича у животных, экспрессирующих polyQ. Для анализа на паралич синхронизированные животные, экспрессирующие unc-54p::p olyQ::YFP, оцениваются на 3, 5, 7 и 9 день взрослой жизни. При необходимости добавляйте дополнительные временные баллы, чтобы расширить диапазон оценки таким образом, чтобы можно было оценить эффект генетического возмущения.
- В дни подсчета очков (3, 5, 7 и 9 день взрослой жизни) посмотрите на 6-сантиметровые пластины, содержащие 50 животных, и запишите количество парализованных животных. Уберите парализованных животных из тарелки. Если животные сползли с тарелки или умерли, их следует подвергнуть цензуре; Запишите событие, чтобы его можно было учесть в анализе.
заметка: Животное считается парализованным, когда не наблюдается никаких движений после воздействия на него легких или мягких прикосновений. Активность глоточного насоса используется для определения того, живы или мертвы неподвижные животные.
- По завершении эксперимента рассчитайте частоту паралича для каждого состояния. Делайте это в каждый момент времени, деля долю парализованных животных на общее количество животных, наблюдаемых в этом состоянии. Если вы наблюдаете несколько пластин в одном условии в определенный момент времени (т. е. реплицируете пластины), рассчитайте соотношение отдельно для каждой репликации.
- Нанесите график прогрессии скорости паралича на графике XY (диаграмма рассеяния). X представляет дни взрослой жизни, а Y — уровень паралича. Частоту паралича у животных unc-54p::p olyQ::YFP сравнивают с контрольными животными (рис. 1C). Проводить статистический анализ между группами; Для нескольких испытаний обрабатывайте испытания независимо. Используйте регрессию пропорциональных рисков Кокса и тест Вальда. Большинство инструментов анализа данных, поддерживающих анализ выживаемости, также поддерживают моделирование Кокса.
- Преобразуйте данные: каждое условие должно иметь два столбца, один для времени, а другой для «события». В каждой наблюдаемой временной точке добавьте строку с «0» для каждого парализованного животного и «1» для каждого подвергшегося цензуре животного. Общее количество рядов должно быть равно количеству стартовых животных на тарелке для этого условия.
- Выполните моделирование пропорциональных рисков Кокса, а затем тест Вальда, в соответствии с инструкциями к статистическому программному обеспечению. Одномерная модель будет подходить для типичных схем экспериментов. Для более чем двух условий, если тест со всеми включенными условиями показывает значимый результат (т.е. p < 0,005), можно провести попарные тесты между условиями для определения конкретной значимой пары (пар) условий><.
заметка: Модель Кокса основана на предположении, что условия теста пропорционально модулируют вероятность события с течением времени. Это означает, например, что модель Кокса не подходит для сравнения состояния, при котором большинство животных парализовано на 1-й день, с состоянием, при котором большинство животных парализовано на 9-й день. Расширения модели Кокса и другие подходы к сравнению пропорций, парализованных в каждый момент времени, доступны для случаев, когда предположение о пропорциональных рисках не выполняется.
