Бактериальный коинкубационный анализ: метод на основе флуоресцентной микроскопии для визуализации внутривидовой бактериальной конкуренции на уровне отдельных клеток

Аннотация

Источник: Smith, S., et al., Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует основанный на флуоресцентной микроскопии метод изучения бактериальной конкуренции на уровне отдельных клеток. Этот метод позволяет получить представление о структуре и функциях бактериальных сообществ.

Протокол

1. Коинкубация штаммов бактерий

1. Выберите два штамма бактерий для анализа конкуренции бактерий на одну клетку. Здесь используются два штамма V. fischeri: целевой штамм (ES11424) и ингибиторный штамм (MJ1125), который, как известно, убивает целевой штамм с помощью системы секреции типа VI на хромосоме II (T6SS2)1, которая является контактно-зависимым механизмом киллинга.
2. Трансформируйте штаммы со стабильными плазмидами, кодирующими гены различных флуоресцентных белков (например, GFP или RFP), чтобы визуально различать типы штаммов на микроскопе. В этом случае штамм ингибитора помечается плазмидой, кодирующей GFP (pVSV102), а целевой штамм помечается плазмидой, кодирующей dsRed (pVSV208).
3. Начните с среднелогарифмических культур для обоих штаммов, измерьте и запишите оптическую плотность на длине волны 600 нм (наружный диаметр₆₀₀) для всех образцов.
4. Нормализуйте каждый образец до наружного диаметра₆₀₀ = 1,0, что соответствует примерно 10,9 КОЕ/мл для V. fischeri, разбавляя культуру средой LBS.
5. Смешайте два конкурирующих штамма в соотношении 1:1 в зависимости от объема, добавив по 30 мкл каждого нормализованного штамма в меченую пробирку объемом 1,5 мл. Вихревая культура смешанного штамма в течение 1-2 с.<бр/> заметка: В некоторых случаях может быть целесообразно смешивать кокультуры в разных соотношениях. Например, когда один сорт растет намного быстрее другого, может потребоваться запустить более медленно растущий штамм с численным преимуществом, чтобы наблюдать за конкурентами. Оптимизация также может потребоваться, если внешний диаметр₆₀₀ не соответствует аналогичному КОЕ/мл для обоих штаммов.
6. Повторите шаг 1.5 для каждой биологической репликации и лечения. В приведенном здесь примере это приведет к получению в общей сложности четырех пробирок со смешанным штаммом: две биологические репликации со штаммом ингибитора дикого типа, смешанным со штаммом-мишенью, и две биологические репликации с мутантным штаммом системы секреции типа VI, смешанным с штаммом-мишенью.
7. Чтобы обеспечить достаточную плотность конкурирующих клеток для контактно-зависимого уничтожения в коинкубации на агаровой прокладке, концентрируйте каждую смешанную культуру в 3 раза, центрифугируя смешанную культуру в стандартной центрифужной пробирке объемом 1,5 мл в течение 1 минуты при 21 130 x g, отбрасывая надосадочную жидкость и повторно суспендируя каждую гранулу в среде объемом 20 мкл фунтов. Повторите для каждого образца.
   заметка: Некоторые бактериальные клетки чувствительны к повреждению при центрифугировании при высоком RCF; В таких случаях смешанную культуру можно центрифугировать в течение 3 мин при 4600 x g. Кроме того, при количественной оценке контактно-зависимой конкуренции важно обеспечить достаточную плотность клеток на предметном стекле для наблюдения за убийством. В этой статье «переполненные» методы лечения, в которых наблюдается умерщвление, имели примерно 10 клеток/20^мкм2.

2. Настройка слайдов

1. При использовании вертикального микроскопа поместите агарозную прокладку ~5 мм² на стандартное стекло диаметром 1 мм. Нанесите 2 мкл смешанной культуры на агарозную подушечку и нанесите на это место покровную крышку #1.5 (25 мм²). Смотрите рисунок 1B.
2. При использовании инвертированного микроскопа нанесите 2 мкл смешанной культуры на дно покровного стекла #1,5 чашки Петри диаметром 35 мм и поместите агарозную прокладку ~5 мм² на место коинкубации. Наденьте на агарозную подушечку круглую стеклянную покровную крышку толщиной 12 мм. Пример приведен на рисунке 1C.
3. Повторите шаги 2.1 или 2.2, в зависимости от используемой конфигурации микроскопа, для остальных трех смешанных культур, в результате чего необходимо получить четыре предметных стекла или чашки.
4. Дайте слайдам постоять на столе примерно 5 минут, прежде чем продолжить. Это позволяет клеткам располагаться на агаровой подушечке и устранять движение во время процесса визуализации.

3. Флуоресцентная микроскопия

1. Начните с фокусировки на клетках с помощью белого света (фазового контраста или DIC), чтобы свести к минимуму последствия фотообесцвечивания. Исходя из среднего размера одной бактериальной клетки, используйте масляную мишень 60x или 100x.
2. Отрегулируйте время экспозиции и параметры сбора данных для каждого канала таким образом, чтобы ячейки были видны в соответствующем канале с минимальным обнаружением фона.
   заметка: Целесообразно использовать разное время воздействия для разных каналов, но одно и то же время воздействия должно использоваться для всех биологических репликатов и обработок для данного канала.
3. Для каждого образца выберите не менее пяти полей обзора (FOV) и получите изображения в каждом соответствующем канале с использованием настроек сбора данных (см. примеры на рисунке 2). Сохраните точки XY из каждого поля зрения, чтобы тот же самый угол обзора мог быть изображен в конечном моменте времени. Визуализация одного и того же поля зрения в каждый момент времени необходима для определения доли площади, занимаемой клетками-мишенями или ингибиторами на этапах анализа.
   заметка: В этом примере флуоресценция GFP детектируется с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 467 - 498 нм и эмиссионным фильтром 513 - 556 нм и имеет ложный зеленый цвет. Флуоресценция dsRed определяется с помощью фильтра с длиной волны возбуждения 542 - 582 нм и эмиссионным фильтром 603 - 678 нм и имеет ложный пурпурный цвет.
4. Через 2 часа повторите вышеуказанный шаг для каждого образца, используя ранее сохраненные точки XY (Рисунок 2).
   заметка: Время получения последующих изображений может потребоваться оптимизировать для организмов с различными темпами роста или конкурентными механизмами.

Результаты

Рисунок 1: Подготовка агарозной прокладки и настройка предметного стекла для анализа коинкубации. (А) Установка для изготовления 2% агарозных подушечек. Пять слоев лабораторной ленты (зеленого цвета) оборачиваются вокруг покровного стекла в двух точках, расположенных на расстоянии примерно 20 мм друг от друга. Затем теплый 2% агарозный раствор в морском фосфатно-солевом буфере (желты...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микроцентрифужная пробирка 1,5 мл	рыбак	Тел.: 05-408-129
Одноканальный дозатор 10 мкл
Одноканальный дозатор объемом 1000 мкл
Одноканальный дозатор 20 мкл
Одноканальный дозатор 200 мкл
агароза	рыбак	БП165-25	Легкоплавкая агароза
Тарелка Cellvis 35 мм	рыбак	NC0409658	#1.5 Дно покровного стекла
Хлорамфеникол	сигма	С0378	исходные запасы (20 мг/мл в этаноле); конечная концентрация в средах (2 мкг/мл LBS)
Программное обеспечение для анализа изображений Фиджи	ИзображениеJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Программное обеспечение с открытым исходным кодом
Чехлы Fisherbrand: круги	рыбак	12-545-81П	#1.5 покровное стекло; диаметр 12 мм
Канамицина сульфат	рыбак	БП906-5	исходный запас (100 мг/мл в воде, стерилизуется фильтром); конечная концентрация в среде (1 мкг/мл фунтов)
Салфетка для чистки линз	рыбак	С24530
Пластины Петри	рыбак	FB0875713	стерильный с крышкой
Лезвия	рыбак	С65921
Полумикро-кюветы	ВВР	97000-586
спектрофотометр
Предметные стекла для микроскопа Thermo Scientific Gold Seal	рыбак	12-518-100Б
Защитное стекло Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	рыбак	Тел.: 22-050-235	#1.5 защитное стекло, 25 мм2
Погружное масло типа F	рыбак	NC0297589
Вертикальный или инвертированный флуоресцентный микроскоп с камерой и программным обеспечением для визуализации			Изображения в этой статье были получены с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Nikon TI-2, оснащенного цифровой CMOS-камерой ORCA-Fusion Digital CMOS, с использованием программного обеспечения NIS-Elements.
вихрь
Водяная баня			Используется для поддержания тепла агарозы перед пипетированием
LBS медиа
1М Трис Буфер (pH ~7,5)			50 мл 1 М буфер (62 мл HCl, 938 мл деионированной воды, 121 г основания Trizma)
Агар Технический	рыбак	ДФ0812-17-9	15 г (Добавить только для тарелок)
Деионизионная вода			950 мл
Хлорид натрия	рыбак	С640-3	20 г
Триптон	рыбак	BP97265	10 г
Дрожжевой экстракт	рыбак	БП9727-2	5 г
mPBS (морская PBS)			Фосфатно-солевой буфер с добавлением морских солей; используется для изготовления агарозной прокладки
10-кратный PBS	рыбак	ICN1960454
Растворимая морская соль	Мгновенный океан	СС1-160П	Отрегулируйте концентрацию до соответствующей солености; здесь используется 20 PSU
Стерильные вакуумные фильтрующие установки	рыбак	SCGVU01RE	Используется для фильтрации-стерилизации mPBS
Вакуумный насос			Используется для фильтрации-стерилизации mPBS