Амплиментированный люминесцентный близости-гомогенный анализ: бесконтактный анализ на основе гранул для скрининга малых молекул, ингибирующих белок-белковые взаимодействия

Аннотация

Источник: Wang, L. et al., Исследования взаимодействий шаперона и кошаперона с использованием однородного анализа на основе гранул. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео мы демонстрируем амплиментированный люминесцентный близости-гомогенный анализ — близостистый анализ на основе шариков. В нем используются акцепторные и донорские шарики одинакового размера, иммобилизованные двумя белками, которые имеют тенденцию взаимодействовать для скрининга потенциальных малых молекул, ингибирующих белковые взаимодействия.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор этого протокола показан на рисунке 1.

1. Экспрессия и очистка GST-FKBP51 и GST-FKBP52 (Рисунок 1A)

1. Плазмиды
   ПРИМЕЧАНИЕ: Получите клоны кДНК человека FKBP51 (идентификатор клона: 5723416) и человека FKBP52 (идентификатор клона: 7474554) от консорциума IMAGE.
   1. Амплифицировать ДНК FKBP51 человека методом ПЦР с праймерами (прямыми; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', обратными; 5'-CTCGAGCTATGCTCTCTCTCTCCAC-3'), содержащими выступы BamHI и XhoI, и клонировать в вектор pGEX6-1 в сайтах рестрикции BamHI/XhoI.
   2. Амплифицировать ДНК FKBP52 человека методом ПЦР с праймерами (прямыми; 5'-GAATTCATGACACAGCCGAGGAGATG-3', обратными; 5'-CTCGAGCTATGCTCTCTCTCTCCAC-3'), содержащими выступы EcoRI и XhoI, и клонировать в вектор pGEX6-2 в сайтах рестрикции EcoRI / XhoI.
      заметка: Настройка и условия проведения ПЦР-реакции приведены в Таблице 1 и Таблице 2.
   3. Проверьте вставленную последовательность и преобразуйте плазмиды в химически компетентную кишечную палочку в соответствии с протоколом производства.
2. Экспрессия и очистка белка
   1. Добавьте 25 г основы бульона Лурия (LB) в 1 л дистиллированной воды, чтобы получился раствор LB. Автоклавируйте при температуре 121 °C в течение 15 мин. После остывания добавьте 50 мкг/мл ампициллина.
   2. Возьмите колонию бактерий, экспрессирующих GST-FKBP51 или GST-FKBP52, и смешайте с 500 мкл раствора LB в пробирке объемом 1,5 мл. Вихрь.
   3. Добавьте смесь "1.2.2" в 1 л раствора LB в колбу Эрленмейера, накрытую алюминиевой фольгой. Инкубируйте колбу Эрленмейера в шейкере на ночь при температуре 37 °C.
   4. Индуцируйте экспрессию белка путем добавления 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактозида (IPTG) в колбу Эрленмейера и продолжайте инкубацию еще 2 ч.
   5. Чтобы получить клеточные гранулы, центрифугируйте при 5 000 x g в течение 15 мин. Удалите надосадочную жидкость.
      заметка: Гранулы ячеек можно хранить при температуре -20 °C.
   6. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 40 мл PBS и обработайте ультразвуком 3 х 20 с на льду. Добавьте 1 мМ PMSF, 1 мМ ЭДТА и коктейль ингибиторов протеазы (1 таблетка) для предотвращения протеолиза.
   7. Центрифугируйте суспензию в течение 30 минут 50 000 x g для удаления клеточного мусора и нанесите надосадочную жидкость на колонку с ловушкой GST объемом 5 мл.
   8. После промывки колонки с 30 мл PBS элюируйте GST-FKBP51 и GST-FKBP52 5 мл 10 мл глутатиона в PBS.
   9. Сконцентрируйте белки на центрифугаторе 10.000 MWCO объемом 15 мл. Для удаления свободного глутатиона концентраты пропускают через колонку PD-10, уравновешенную 0,5x PBS, и снова концентрируются на фильтрующем центрифуге.
   10. Соберите белоксодержащие фракции. Проверьте белки в SDS-PAGE и отрегулируйте концентрацию белка до 1 мг/мл.
       заметка: Типичный выход белка составляет 2-5 мг/л культуры Белок можно хранить при температуре -20 °C.

2. Связывание С-концевого пептида Hsp90 с акцепторными шариками (Рисунок 1B)

1. Пептидный препарат Hsp90
   1. Синтезировать пептид из десяти аминокислот NH 2-EDASRMEEVD-COOH, соответствующий аминокислотам 714-724 изоформы Hsp90 бета человека (UniProt ID: P08238) с помощью услуги по синтезу пептидов.
   2. Разбавьте пептид Hsp90 в PBS до концентрации 1 мг/мл.
2. Подготовка приемных швов
   1. Развести неконъюгированные акцепторные шарики в PBS до концентрации 1 мг/мл и переложить в пробирку объемом 1,5 мл.
   2. Промывайте методом центрифугирования при давлении 16 000 х г в течение 15 мин. Осторожно удалите надосадочную жидкость.
3. спряжение
   1. Установите соотношение между бусинами и пептидом 10:1. В пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мг акцепторной гранулы (приготовленную, как описано выше), добавьте 1 мл PBS (pH 7,4), 0,1 мг разведенного пептида, 1,25 мкл Tween-20, 10 мкл 400 мМ раствора цианоборогидрида натрия (NaBH₃CN) в воду.
      осторожность: NaBH₃CN токсичен; Используйте вытяжной шкаф и перчатки. Раствор NaBH₃CN должен быть свежеприготовленным.
   2. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C с перемешиванием из конца в конец (10-20 об/мин) на ротационном шейкере.
4. Реакционная закалка и промывка шариков
   1. Добавьте 20 мкл 1 М раствора Tris-HCl (pH 8,0) в реакцию для блокирования непрореагировавших участков. Выдерживать в течение 1 ч при 37 °C.
   2. Центрифугируйте при 16 000 x g (или максимальной скорости) в течение 15 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу гранул в 1 мл раствора Tris-HCl (100 мМ, pH 8,0).
   3. Повторите этап стирки три раза.
   4. После последнего центрифугирования повторно суспендировать гранулы в концентрации 1 мг/мл в буфере для хранения (1 мл 0,5 × PBS с 0,01% азида натрия в качестве консерванта). Храните сопряженный раствор акцепторного шарика при температуре 4 °C в защищенном от света месте.
      осторожность: Азид натрия токсичен; Используйте вытяжной шкаф и перчатки.

3. Анализ, исследующий взаимодействие между GST-FKBP51 или GST-FKBP52 и Hsp90 C-концевым пептидом, а также ингибирование соединениями с низкой молекулярной массой (Рисунок 1C)

1. Белки, меченные GST, взаимодействуют с донорскими гранулами глутатиона
   1. Настройте реакции в 384-луночных планшетах.
   2. Приготовьте раствор, содержащий 10 мкг/мл донорских гранул глутатиона в 0,5x PBS, pH 7,4,
      заметка: После длительного хранения бусины оседают и их нужно завихривать.
   3. Добавьте GST-FKBP51 или GST-FKBP52 до конечной концентрации 10 мкг/мл.
   4. Инкубировать в темноте при температуре 25 °C в течение 10 мин.<бр/> заметка: На этом этапе белки, помеченные GST, будут взаимодействовать с глутатионом, прикрепленным к гранулам. На каждую лунку будет использоваться 22,5 мкл этой смеси. Концентрация связывающих партнеров должна быть определена опытным путем. Титруйте GST-FKBP51 и GST-FKBP52 и выберите концентрацию, которая дает наилучший сигнал.
2. Добавление компаунда
   1. Производить серийные разведения исследуемых соединений в ДМСО.<бр /> заметка: Обычно используются концентрации 10, 30, 100, 300, 1000 и 3000 мкМ.
   2. Добавьте 0,25 мкл ДМСО (отрицательный контроль) или Hsp90 C-концевого пептида (положительный контроль, 30 мкМ) или соединений в ДМСО в угол каждой лунки планшета. Используйте трипликаты для каждой концентрации соединения.
   3. Добавьте в каждую лунку по 22,5 мкл раствора, содержащего гранулы донора глутатиона с белками, меченными GST.
   4. Осторожно, но тщательно встряхните тарелку. Выдерживать в темноте при температуре 25 °C в течение 15 мин.<бр/> заметка: В течение этого времени соединения будут взаимодействовать с доменом TPR в сайте связывания С-концевого пептида Hsp90.
3. Добавление акцепторных бусин
   1. Разбавьте акцепторные шарики с присоединенным С-концевым пептидом Hsp90 до 100 мкг/мл в 0,5x PBS.
   2. Добавьте в каждую лунку по 2,25 мкл разведенных акцепторных шариков.
   3. Перемешайте аккуратно, но тщательно. Выдерживать в темноте при температуре 25 °C в течение 15 мин.<бр/> заметка: На этом этапе донорные и акцепторные бусины сблизляются за счет белок-пептидных взаимодействий. Конечный объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Таким образом, конечные концентрации соединений находятся в диапазоне от 0,1 до 30 мкМ.
4. Показания на табличке
   заметка: Считывание показаний с таблички с помощью считывателя пластин, установленного в соответствующем режиме.
   1. Включите прибор и откройте программное обеспечение
   2. Выберите соответствующий протокол.
   3. Щелкните Редактировать карту пластин и выберите скважину, используемую в пластине для измерения.
   4. Нажмите Далее, чтобы продолжить, и Запустить выбранный протокол.
   5. После измерения нажмите «Показать результаты», чтобы просмотреть результаты.
   6. Экспортируйте данные.

Таблица 1: Настройка ПЦР-реакции для амплификации ДНК человека FKBP51 и FKBP52.

мм

Компонент реакции	Объем (μл)
Буфер для ПЦР (5 x концентрат)	4
Передний праймер	1
Обратный праймер	1
Плазмидные	0,5
Микс dNTP (по 10 мМ каждый)	0,5
Фузионная ДНК-полимераза	0,5
Вода (класс ДНК)	12,5
итог	20

Таблица 2: Термоцикловые условия для амплификации ДНК человека FKBP51 и FKBP52.

сцена	Температура (°C)	Время	Циклов
Первичная денатурация	94	3 мин	1
денатурация	94	30 сек	35
отжиг	56	30 сек
расширение	72	1 мин
Окончательное продление	72	5 мин	1
Примечание: температура крышки составляет 105 °C.

Результаты

Рисунок 1: Схема этого протокола. (A) Экспрессия и очистка GST-FKBP51 и GST-FKBP52. (B) Соединение Hsp90 C-концевого пептида с акцепторными шариками. (C) Анализ, исследующий взаимодействие между GST-FKBP51 или GST-FKBP52 и Hsp90 C-концевым пептидом. Ингибирование соединениями с малой молекулярной массой.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
384-луночные планшеты	Перкин Элмер	6008350	Объем пробы 25 мл
Центрифужная установка Amicon 10.000 MWCO	Многородность	UFC901008	Концентрат белка
Ампициллин	сигма	А0166	антибиотики
Шейкер для бактерий Unimax 1010	Гейдольф		Культивирование бактерий
Клоны кДНК для человека FKBP51	Источник: Бионаука	ID клона: 5723416	Вектор pCMV-SPORT6
Клоны кДНК для человека FKBP52	Источник: Бионаука	ID клона: 7474554	Вектор pCMV-SPORT6
Химически компетентная кишечная палочка	Инвитроген	C602003	Ваншот BL21 Star (DE3)
Дмсо	Supelco	1.02952.1000	Разбавленные соединения
ДПБС	Gibco	14190-144	Приготовьте раствор
Эдта	Кальбиохим	344504	Предотвращение протеолиза во время ультразвуковой обработки
Глутатион	сигма	Г-4251	Белки, помеченные GST
Бусины-доноры глутатиона	Перкин Элмер	No 6765300	Донорская бусина
Колонна для ловушек НДС	Цитива (GE Healthcare)	17528201	Очистка белков с меткой GST
Изопропил-β-D-тиогалактозид	Thermo Fisher Scientific	Р0392	Стимулирование экспрессии белка
LB Бульон (Миллер)	сигма	Л3522	Микробная среда для выращивания
Инструмент для ПЦР	БИО-РАД	Термоамплификатор S1000	Амплификация/ПЦР
Колонна ПД-10	Цитива (GE Healthcare)	17085101	Обмен решениями
Вектор pGEX-6P-1	Цитива (GE Healthcare)	28954648	Плазмидные
Вектор pGEX-6P-2	Цитива (GE Healthcare)	28954650	Плазмидные
Считыватель пластин	Перкин Элмер	Многоканальный считыватель EnSpire 2300	Считывание альфа-пластины
Программное обеспечение для считывания пластин	Перкин Элмер	Менеджер EnSpire	Программное обеспечение для считывания пластин
Протокол программного обеспечения для считывания номерных знаков	Перкин Элмер	Alpha 384-луночный Малый объем	Использование этого протокола для считывания пластины
ПМСФ	сигма	П7626	Предотвращение протеолиза во время ультразвуковой обработки
Коктейль ингибиторов протеазы	сигма	С8830	Предотвращение протеолиза во время ультразвуковой обработки
Азид натрия	сигма	С2002	В качестве консерванта
Цианоборогидрид натрия (NaBH3CN)	сигма	156159	Активирует матрицу для сопряжения
Пептид десяти аминокислот NH2-EDASRMEEVD-COOH, соответствующий аминокислотам 714-724 изоформы Hsp90 бета человека	Пептид 2.0 инк		Синтез Hsp90 C-концевого пептида
Вращатель пробирки	ЛАБИНКО		Сделайте сквозное перемешивание
Трис-HCl	сигма	10708976001	Блокировка неотреагировавших сайтов акцепторных бусин
Подросток-20	сигма	П1379	Предотвращение агрегации бусин
Ультрацентрифуга Avanti J-20 XP	Бекман Коултер		Центрифуга для получения гранул клеток бактерий
Ультразвуковой дезинтегратор ячеек	Микрозон		Ультразвук клеток для высвобождения белка
Несопряженные акцепторные бусины	Перкин Элмер	6762003	Акцепторные бусины
XCell SureLock Mini-Cell и модуль XCell II Blot	Инвитроген	ЭИ0002	SDS-СТРАНИЦА

гг.