Анализ вирусных бляшек: метод измерения инфекционного вируса простого герпеса путем количественной оценки бляшек, образующихся в монослое инфицированных вирусом клеток

Аннотация

Источник: Садовски, Л. А. et al. Бляшки вирусов простого герпеса. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео описывается анализ вирусных бляшек на инфекционный вирус простого герпеса или ВПГ. Разведенные вирусные частицы инокулируются в монослой эпителиальных клеток. При инкубации вирус образует бляшки и подсчитывается визуально для определения титра инфекционного вируса.

Протокол

1. Затравка ячеек Vero

1. За день до начала анализа бляшек трипсинизируйте клетки Vero и повторно суспендируйте их в обычной модифицированной среде Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) и дополните в соответствии со стандартной методологией культивирования клеток. Ресуспендируйте трипсинизированные клетки в 10 мл DMEM на колбу T-75 сливающихся клеток Vero (~10⁷ клеток).
   ПРИМЕЧАНИЕ: DMEM используется для анализа бляшек вместо альфа-MEM, потому что он немного замедляет скорость роста клеток и способствует лучшим результатам анализа бляшек.
2. Подсчитайте клетки удобным для вас методом (например, стандартным гемоцитометром с исключением Trypan Blue).
3. Засейте клетки по 4 x 10⁶ клеток/пластину; при ВПГ-2 использовать 6-луночные планшеты с 2,5 мл DMEM (с добавками) на лунку; а для ВПГ-1 используйте 12-луночные планшеты с 1,25 мл DMEM (с добавками) на лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток должно быть постоянным независимо от используемой пластины, хотя размер лунок имеет значение для точности анализа бляшек. Важно обеспечить равномерное распределение ячеек, что может быть наиболее эффективно достигнуто путем перемещения пластины вперед и назад, а не по кругу.
4. Дайте клеткам вырасти в течение ночи при 37 °C/5% CO₂ в увлажненном инкубаторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Влажность поддерживается с помощью кастрюли с дистиллированной водой, содержащей альгицид на дне инкубатора.

2. Разведение пробы

1. Завершите разведение образца и добавление вируса в клетки за один лабораторный сеанс.
   ВНИМАНИЕ: ВПГ-1 и -2 заразны для человека и должны обрабатываться в условиях надлежащей биологической безопасности (BSL-2). Храните все материалы, вступающие в контакт с вирусом, отдельно и дезинфицируйте четвертичным средством в разведении 1/256 (см. Таблица материалов), йодофором, отбеливателем или сильным ионным моющим средством (например, SDS) перед тем, как вынуть их из шкафа биобезопасности.
2. На следующий день после посева клеток Vero последовательно разбавляйте каждый образец вируса, который должен быть забит в 1x PBS; Обычно используют 10-кратные разведения для наиболее точного отслеживания.
3. Проводите эти разведения через 10^-4 (для низких концентраций вирусов) или через 10^-9 (для ожиданий образцов с более высоким титром), оставляя не менее 1 мл каждого образца для самого анализа бляшек.
4. Держите все вирусные разведения на льду (не дольше 1 часа) до тех пор, пока не будете готовы добавить эти разведенные образцы вируса в клетки.

3. Добавление вируса в клетки

1. Удалите питательную среду из одной или двух лунок с помощью пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте аспиратор, потому что он удаляет слишком много жидкости из монослоя клеток и высушивает клетки. Одним из важнейших соображений является обеспечение того, чтобы монослой клетки оставался гидратированным на протяжении всего эксперимента. Если ячейки высохнут, они смоются с пластины на последнем этапе и сгенерируют непригодные для использования данные. Поэтому обрабатывайте только одну или две скважины за раз, чтобы уменьшить эту возможность.
2. Осторожно добавьте разведенный образец вируса (100-400 мкл и 50-200 мкл образца вируса используются для 6-луночных и 12-луночных планшетов соответственно) по каплям в каждый монослой, добавляя капли вниз по стенке каждой лунки. Повторяйте процесс для каждой одной или двух лунок до тех пор, пока вся пластина не будет заполнена образцами вируса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление капель в центр лунки может непреднамеренно отслаивать клетки от субстрата.
3. Осторожно покачивайте всю пластину вручную, чтобы убедиться, что PBS, содержащая вирус, покрывает весь монослой клеток в каждой лунке, затем поместите пластину в инкубатор CO₂ при температуре 37 °C, чтобы вирус мог адсорбироваться.
4. Каждые 10 мин в течение 1 ч извлекайте пластину из инкубатора, осторожно покачивайте ее еще раз, чтобы вирус более равномерно распределился по каждой лунке, а затем поместите обратно в инкубатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый эксперимент будет диктовать количество повторов и используемые разведения; Предпочтения читателя диктуют это решение.
5. Чтобы уменьшить вероятность случайного подсчета неабсорбированного инокулюма, извлеките образец вируса из лунок с помощью наконечников пипетки объемом 1000 мкл и поместите его в стакан для отходов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, эта процедура проводится только с одной или двумя лунками за раз для поддержания гидратации монослоя клетки.
6. Поместите 2,5 мл слоя метилцеллюлозы (растворите 5% метилцеллюлозы w/w в 100 мл PBS, автоклав в течение 15 минут при 121 °C и 15 фунтах на квадратный дюйм в жидком цикле, затем добавьте 375 мл DMEM плюс 25 мл FBS).
7. Как только вся пластина будет покрыта, поместите пластину обратно в инкубатор, чтобы дать ей возможность расти в течение двух дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если позволить вирусу и клеткам расти в течение трех дней, даже в DMEM плюс добавки, это может привести к существенной потере клеток в монослое, что поставит под угрозу окончательные данные.
8. Продезинфицируйте стакан для отходов, как правило, с добавлением отбеливателя, йодофора или аналогичного вироцида, прежде чем вынимать его из шкафа биобезопасности.

4. Окрашивание для бляшек

1. После двухдневной инкубации удалите слой метилцеллюлозы с помощью пипетки, снова по одной или двум лункам за раз, и поместите его в стакан для отходов.
2. Добавьте ~2 мл 1% кристаллического фиолетового (см. Таблица материалов) в 50% этаноле в каждую лунку, чтобы окрасить бляшки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно удалять все до последней капли наложения.
3. Инкубируйте планшет со всеми лунками, заполненными морилкой, в течение 30 минут при температуре 37 °C. На этом этапе продезинфицируйте стакан для отходов, как описано выше в шаг 3.8.
4. Энергично промойте пластины водой из-под крана, пока сток не станет прозрачным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкий поток воды недостаточно силен; Требуется полное давление от приспособления для лабораторной раковины.
5. На этом этапе убедитесь, что количество бляшек в каждой серии разведения примерно в 10 раз меньше.
6. Дайте пластинам высохнуть в течение ночи вверх ногами, после чего можно пересчитать отдельные бляшки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12-луночные планшеты	Corning	3512
6-луночные планшеты	Corning	3516
Alpha-MEM	Lonza	12169F
Антибиотик/антимикотик	Gibco	15240096
Кристаллический фиолетовый	Alfa Aesar	B2193214
DMEM	Gibco	11965092
DulbeccoPBS (без Mg++ или Ca++)	Gibco	14190144
Сыворотка теленка	плода Millipore-Sigma	TMS-013-B
L-аланил-L-глютамин (Глутамакс)	Gibco	GS07F161BA
Гемацитометр	Thermo Fisher	02-671-54
Метилцеллюлоза	Millipore-Sigma	27-441-0
Четвертичный агент (Lysol I.C.)	Thermo Fisher	NC9645698
Trypan Blue	Corning	25900CI
Трипсин	Цитива	SH30042.01
Клетки Vero	ATCC	CCL-81