Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Проба ТУНЕЛЯ
- Усыпляют животных с клиническими признаками хитридиомикоза и равное количество Bd-отрицательных животных в контрольной группе.
- Препарируйте образцы кожи (спинной, брюшной и бедренной) каждого животного. Зафиксируйте образцы кожи в течение 2 часов в 4% фосфатном буферном формальдегиде. Короткое и стабильное время фиксации позволяет полностью фиксировать ткани, а также обеспечивает эффективное и точное иммуногистохимическое окрашивание. Затем переведите на 80% этанол до заделки для разделки.
- Погрузите кожу в парафин для гистологической подготовки в соответствии со стандартными методами. Вкратце протокол выглядит следующим образом:
- Обезвоживайте ткани в виде градуированного ряда этанола и очищайте этанол с помощью ксилола. Погрузите ткань в парафин и поместите все три образца кожи для каждой особи в один парафиновый блок.
- Срез кожи с помощью микротома в соответствии со стандартной гистологической подготовкой. Разрез ткани последовательно на 5 мкм, а затем прикрепление к гидрофильным стеклянным предметным стеклам. Разместите четыре последовательных гистосекса для каждого типа кожи на слайде. Сделайте по три предметных стекла на каждого человека с последовательными срезами кожи, помните, что на каждом слайде прикреплено по четыре среза каждой ткани.
- Окрашивайте предметные стекла в следующем порядке:
- Первое предметное стекло окрашивают гематоксилином, а затем проводят противоокрашивание эозином (H&E). Этот слайд предназначен для визуализации расположения спорангиев Bd в коже.
- Окрасьте второе предметное стекло после коммерчески доступного анализа TUNEL для гистологического препарата и следуйте инструкциям производителя, которые описаны ниже.
- Сначала депарафинизируйте срезы ткани в банке с коплином, промыв предметные стекла тремя сменами ксилола в течение 5 минут за промывку, а затем двумя сменами 100% этанола в течение 5 минут каждая стирка. Затем промывка 95% этанола в течение 3 минут, а затем 70% этанола в течение 3 минут. Закончите одной промывкой PBS в течение 5 минут.
- Предварительно обработайте ткань свежеразведенным ферментом, расщепляющим белок (протеиназа К в концентрации 20 мкг/мл, разведенная в PBS), и добавьте непосредственно на предметное стекло. Дайте поинкубироваться в течение 15 минут. Вымыть с двумя сменами PBS в банке с коплином по 2 минуты каждая.
- Сбейте лишнюю жидкость и утолите в 3,0% перекиси водорода в PBS в банке с коплином в течение 2 минут при комнатной температуре. Дважды промойте PBS, по пять минут при каждой стирке.
- Стряхните лишнюю жидкость, затем нанесите 75 μл/5см2 равновесного буфера непосредственно на ткань на предметном стекле. Инкубировать в течение 10 с. Стряхните лишнюю жидкость вокруг секции и нанесите 55 мкл/5см2 рабочего концевого фермента дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT). Инкубировать в увлажненной камере в течение 1 ч при 37 °C.
- После инкубации TdT поместите предметное стекло в коплиновую банку с рабочим упором/промывочным буфером, перемешайте в течение 15 секунд и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Вымойте предметное стекло с тремя сменами PBS в течение 1 минуты за промывку. Сотрите лишнюю жидкость.
- Нанесите на ткань конъюгат антидигоксигенин (родамин), нагретый до комнатной температуры, 65 μл/5 см2 . Инкубировать во влажной камере в течение 30 минут при комнатной температуре, избегать воздействия света. Стирайте с четырьмя сменами PBS в течение 2 минут за одну стирку. Сотрите лишнюю жидкость.
- В завершение добавьте на предметное стекло 15 мкл 0,5 - 1 мкг/мл DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) в среду для монтажа предметного стекла, которая действует как противоморочное пятно. Затем накройте крышкой и заклейте лаком для ногтей или резиновым цементом. Дайте предметным стеклам высохнуть в темноте, так как анализ светочувствительный.
- Окрасьте третье предметное стекло с помощью анализа TUNEL и противостойного пятна DAPI, но используйте в качестве положительного и отрицательного контроля для каждого образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из 4 гистосекций на контрольных слайдах первые 2 являются положительными контрольными репликациями, а последние 2 - отрицательными контрольными репликациями.
- Для положительного контроля, вместо шага 1.5.2.2, предварительно обработайте ткань DN-буфером (30 мМ тризма-основание, pH 7,2, 4 мМ MgCl2, 0,1 мМ ДДТ) и дайте инкубироваться при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем растворите Dnase I в DN-буфере до окончательной концентрации 0,1 мкг/мл и нанесите его непосредственно на предметное стекло. Выдерживайте в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем промойте предметное стекло 5 промывками dH2O в течение 3 минут при каждой стирке. Промокните лишнюю жидкость. Затем возобновите анализ TUNEL в соответствии с указаниями в разделе 1.5.2.3.
- Для отрицательного контроля не добавляйте в эти образцы фермент терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT) (как описано в разделе 1.5.2.4).
2. Наблюдайте за предметными стеклами TUNEL сразу после завершения анализа.
- Сделайте фотографии через случайные промежутки времени вдоль каждого участка кожи с кратностью 200X с помощью флуоресцентного микроскопа, используя фильтры как для красителя родамина, который показывает апоптотические клетки и становится красным, так и для DAPI, который раскрывает все ядра и выглядит синим, чтобы можно было создать наложение клеток. Убедитесь, что на каждый срез кожи сфотографировано не менее 100 клеток. Храните предметные стекла в темной коробке для микроскопа при температуре -20 °C.
- Подсчет ячеек (окрашенных в синий цвет DAPI) на изображение. Убедитесь, что на каждом участке кожи подсчитывается не менее 100 клеток. Чтобы достичь 100 ячеек, посчитайте все ячейки на изображении. Если на одном изображении присутствует менее 100 клеток, подсчитайте еще одно изображение, пока не будет достигнуто по крайней мере 100 клеток на одном участке кожи на животное.
- Затем подсчитайте количество TUNEL-положительных клеток на тех же изображениях (окрашенных красным родамином). TUNEL-положительные клетки, которые указывают на апоптоз, а не на некроз или фон, представляют собой одиночные клетки с четкими клеточными краями (мембраны не повреждены и не имеют лизиса). Иногда клетки сжимаются, образуя апоптотические тела.
- Найдите участки, подсчитанные в анализе TUNEL, и проанализируйте соответствующие участки на гистосрезах, окрашенных H&E. Убедитесь, что окрашенные H&E срезы соответствуют участкам Bd-инфекции, что обеспечивает использование Bd-инфицированных сайтов при подсчете апоптотических клеток в анализе TUNEL.
