Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Животноводство и мониторинг
- Содержать животных индивидуально, в соответствующей для вида среде, с соответствующим графиком воды, кормления и уборки. Проверяйте животных ежедневно.
- Используйте взрослых особей Litoria verreauxii alpina, находящихся под угрозой исчезновения (для анализа Casspase 3/7, раздел 4), пожертвованных из питомников в неволе. Поддерживайте животных при температуре 15 - 18 °C на субстрате из мха и гравия, ежедневно опрыскивайте их водой обратного осмоса и кормите их 3 раза в неделю сверчками, нагруженными кишечником.
- Собирайте данные о каждом человеке раз в неделю. Возьмите мазок у особей на Bd, как описано в шаге 2.1. Взвесьте каждое животное с точностью до 0,1 г с помощью весов и измерьте длину их рыла до вентиляционного отверстия (SVL) с точностью до 0,01 мм с помощью циферблатных штангенциркулей.
- После прививки (как описано в разделе 3) ежедневно проверяйте животных на наличие клинических признаков инфекции (неравномерное шелушение кожи, отсутствие аппетита, покраснение ног, вялость или замедленный рефлекс коррекции) в соответствии с рекомендациями по этике животных. Усыпляйте животных при наличии клинических признаков и заболеваемости.
- Эвтаназия с передозировкой трикаина метансульфоната (MS222) (0,1% по сравнению с MS222 до pH 6 - 7 с бикарбонатом натрия в выдержанной водопроводной воде). Оставьте животных в MS222 на 10 минут после того, как все движения прекратятся и они не будут реагировать на раздражители.
2. Тестирование на Bd-инфекцию
- Тампонирование для Bd
- Промокните каждое животное новым стерильным тампоном из вискозы (один тампон на животное). Используйте следующий метод взятия мазка: пять раз на вентер и по пять раз на каждое бедро, бок и конечность. Это в сумме 45 ударов.
- Аккуратно вращайте тампон во время и между движениями, чтобы обеспечить эффективный захват ДНК. Разломайте наконечник тампона на микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и храните при температуре -20 °C до извлечения.
- Экстракция ДНК и количественное ПЦР
- Извлеките геномную ДНК из тампонов, добавив 50 мкл коммерчески доступного реагента для экстракции ДНК с 30 - 40 мг 0,5 мм гранул диоксида кремния. Бисер взбивает образцы в разрушителе ячеек бисера на максимальной скорости в течение 2 минут. После этапа бисеробития центрифугируйте образцы при давлении 2 000 x g в течение 1 минуты.
- Инкубируйте образцы при температуре 100 °C в течение 10 минут и дайте им остыть. Центрифугируйте образцы при давлении 5 000 x g в течение 3 минут, а затем перенесите надосадочную жидкость в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и храните при температуре -20 °C до количественной ПЦР.
- Используйте количественную ПЦР (кПЦР) в соответствии с Boyle et al. 2004 для анализа нагрузки инфекции. Используйте следующие модификации:
- Разбавьте образцы для экстракции ДНК в соотношении 6:100 с двойной деионизированной водой. Добавьте 0,7 мкл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в каждую лунку, чтобы предотвратить ингибирование ПЦР. Запустите каждый образец в единственном числе. На каждой пластине используйте отрицательный (без шаблона) контроль и положительный контроль с рядом стандартов разведения для оценки зооспоровой (инфекционной) нагрузки.
3. Инокуляция
- Культура Bd
- Приготовьте питательный бульон, добавив в 1 л деионизированной воды 16 г триптона, 2 г гидролизата желатина и 4 г лактозы (TGHL). Автоклав (121 °C в течение 40 мин) и дайте бульону остыть.
- Инокулировать изолят Bd (в данном случае выделенный из изолята Нового Южного Уэльса, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, Passage number 11) в бульон TGHL и выращивать в течение 7 дней при 23 °C, затем перенести культуру бульона в агаровые планшеты TGHL.
- Для изготовления пластин добавьте 16 г триптона, 2 г гидролизата желатина, 4 г лактозы (TGHL) и 10 г бактериологического агара в 1 л деионизированной воды и автоклав (121 °C в течение 40 мин). Как только смесь достаточно остынет на ощупь, но до того, как она застынет, насыпьте агар TGHL в культуральные планшеты диаметром 92 мм, чтобы они были заполнены на 1/4-1/3, в шкафу биологической безопасности класса II.
- Когда агар застынет и полностью остынет, внесите в каждую пластину 0,5 мл Bd из жидкого бульона и равномерно распределите. Дайте смеси Bd высохнуть на тарелке в течение примерно 1 часа, а затем запечатайте пластины пластиковой парафиновой пленкой. Инкубируйте тарелки агаровой стороной вниз при 23 °C в течение 5 - 7 дней.
- Затопляющие пластины для раствора для инокуляции зооспор
- Проверяйте подвижность зооспор под микроскопом с инвертированным светом, чтобы убедиться в жизнеспособности ежедневно перед инокуляцией. Когда выброс зооспор высокий, когда многие зооспоры выходят за пределы спорангий, культура готова к инокуляции.
- Наполните каждую тарелку 3 мл выдержанной водопроводной воды или воды из искусственного пруда, налив воду в тарелку и инкубируя при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы зооспоры могли выйти в воду. После инкубационного периода сцедите суспензию зооспор в новую стерильную емкость.
- Оценивайте концентрацию зооспор в соответствии с инструкциями производителя с помощью гемоцитометра. После того, как концентрация зооспоровой суспензии известна, разбавьте суспензию до концентрации 1 x 106 зооспор на 3 мл с выдержанной водопроводной водой.
- Прививайте животных
- Прививайте каждое животное, выливая 3 мл инокулюмной смеси на его венер в отдельных емкостях объемом 50 мл. Дайте излику инокулянта собраться в основании контейнера для инокуляции. Оставьте каждое животное в индивидуальном контейнере для прививок на 24 часа, чтобы убедиться в заражении, а после 24-часовой инокуляции верните каждого человека в продезинфицированный террариум.
- Продезинфицируйте террариумы с помощью 13% объема/объема (v/v) коммерческого раствора отбеливателя, промойте не менее двух раз водой, затем дайте высохнуть не менее 24 часов.
- Для Bd-отрицательного контроля имитационную инокуляцию животных следует проводить с использованием тех же методов, что и в 3.2 - 3.3, но вместо агаровых пластин, не содержащих Bd, заполнять агаровые пластины без Bd 5 мл выдержанной водопроводной воды.
4. Анализ каспазы 3/7
- Собирайте кончики пальцев ног у каждого животного (как с Bd-экспонированными, так и с Bd-отрицательными) один раз в неделю в течение 3-й недели после прививки и раз в две недели до конца эксперимента, до 8 пальцев на одну особь.
- Разрежьте кончик пальца на второй фаланге стерилизованными пламенем ножницами, поместите в микропробирку объемом 1,5 мл и немедленно заморозьте при -80 °C.
- Извлеките белки из замороженного образца пальца ноги.
- Поместите образцы в 100 мкл буфера для образцов (25 мМ HEPES pH 7, 5 мМ MgCl2) с двумя шариками из нержавеющей стали (3,2 мм) в микропробирку с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 мл. Лизируйте образцы в течение 4 циклов по 1 минуте взбивания бусин на максимальной скорости (в той же бисерной машине, которая использовалась на шаге 1.2.1) с последующим 3 минутами на льду. После лизиса центрифугируйте образцы при 12 000 x g и 4 °C в течение 5 минут. Соберите надосадочную жидкость для использования в анализе.
- Количественно оцените концентрацию белка в образце с помощью анализа Брэдфорда.
- В 384-луночном планшете смешайте 10 μл белкового экстракта с 10 μЛ реагента Bradford и инкубируйте в течение 2 минут при комнатной температуре. Выполняйте каждый образец в двух экземплярах вместе с серией 5-кратных стандартов разбавления BSA. Считывание коэффициента поглощения на длине волны 595 нм на считывателе абсорбционной пластины.
- В качестве альтернативы, если образцы кончиков пальцев ног слишком малы (концентрация белка близка к самой низкой норме, определенной по результатам анализа Брэдфорда, или если общий вес лягушек, которые были отобраны, составляет менее 3 г), стандартизируйте образцы, оценив площадь поверхности кожи с помощью фотографий, а не по анализу Брэдфорда.
- Перед извлечением белков из образца для анализа каспазы сфотографируйте каждый палец ноги с 40-кратным увеличением с помощью микроскопа с инвертированной подсветкой.
- Проанализируйте образец пальца ноги с помощью программного обеспечения для компьютерной визуализации, оценив площадь пальца ноги. Для этого нарисуйте линию по краю зажима для пальца ноги и попросите программное обеспечение для обработки изображений оценить область внутри формы. Затем умножьте эту площадь на число пи (3,14), что приблизит площадь поверхности трехмерного образца кожи (как длина х площадь поперечного сечения (пи х диаметр) дает площадь внешней поверхности пробирки).
- Проведите анализ каспазы 3/7.
- В 384-луночный люминесцентный планшет добавьте 10 мкл коммерчески доступного реагента каспазы 3/7 и 10 мкл белкового экстракта. Запустите каждый образец в трех экземплярах.
- Смешайте реагенты, медленно встряхивая планшет в течение 15 с. Инкубируйте планшет вдали от света в течение 30 минут при комнатной температуре. Измерьте люминесценцию с помощью считывателя люминесцентных пластин.
