Анализ фагоцитоза: метод иммуноокрашивания для визуализации поглощения апоптотических клеток в эмбриональных клетках Drosophila melanogaster

Аннотация

Источник: Нонака, С. и др. Анализ фагоцитоза для апоптотических клеток в эмбрионах дрозофилы. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео демонстрирует технику иммуноокрашивания для визуализации поглощения апоптотических клеток в гомогенизированных эмбриональных клетках Drosophila melanogaster. Этот метод дает представление о клеточной физиологии путем определения степени поглощения апоптотических клеток.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Окрашивание гемоцитов

1. Иммуноокрашивание антителом к крокеморту
   1. Стеклянные предметные стекла последовательно замочить в метаноле на 10 мин, в PBS, содержащем 0,2% (v/v) Triton X-100 на 10 мин, а затем в PBS на 10 мин.
   2. Поместите 20 мкл 5% (v/v) цельной сыворотки свиней в PBS, содержащую 0,2% (v/v) Triton X-100, на клетки для блокирования. Инкубировать предметные стекла при комнатной температуре в течение 20 минут.
   3. Удалите раствор со стекол и поместите 20 мкл антикрокемортской антисыворотки (0,1% (v/v)) в PBS, содержащую 0,2% (v/v) Triton X-100 на клетки. Инкубируйте предметные стекла при температуре 4 °C в течение ночи.
   4. Замочите стеклянные предметные стекла в PBS, содержащем 0,2% (v/v) Triton X-100, на 10 минут 5 раз.
   5. Замочите стеклянные предметные стекла в PBS на 10 минут.
   6. Поместите 20 мкл меченного щелочной фосфатазой антикрысиного IgG (0,5% (v/v)) в PBS, содержащий 0,2% (v/v) Triton X-100 и 5% (v/v) цельной сыворотки свиней, на клетки при комнатной температуре в течение 1 ч.
   7. Замочите стеклянные предметные стекла в PBS, содержащем 0,2% (v/v) Triton X-100, на 10 минут 5 раз.
   8. Замочите предметные стекла в буфере, содержащем 100 мМ Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl и 50 мМ MgCl2 на 10 минут.
   9. Субстратный раствор монтированной фосфатазы, содержащий 0,23 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP), 0,35 мг/мл нитросинего тетразолия (NBT), 100 мМ Tris-HCl, pH 9,5, 100 мМ NaCl и 50 мМ MgCl₂ на клетках.
   10. Наблюдайте за клетками под микроскопом для правильного окрашивания. При появлении сильных фиолетовых сигналов в гранулах гемоцитов удалите раствор субстрата и замочите стеклянные стекла в буфере, состоящем из 10 мМ Tris-HCl, pH 8,5 и 1 мМ ЭДТА. Рекомендуется окрашивание в течение примерно 5 - 10 минут.

2. Окрашивание апоптотических клеток от TUNEL

1. Замочите стеклянные предметные стекла в PBS на 5 минут.
2. Повторите с новым PBS.
3. Установите буфер Equilibration (см. таблицу материалов) на ячейки на 10 минут.
4. Снимите раствор со стекол и установите 20 мкл раствора TdT, содержащего 5 мкл терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и 15 мкл реакционного буфера, на клетки при 37 °C на 1 ч.
5. Снимите раствор со стекол и замочите предметные стекла в буфере, состоящем из 0,5 мл буфера STOP/Wash и 17 мл воды.
6. Замочите горки в PBS на 5 мин 3 раза.
7. Поместите 20 мкл анти-дигоксигенин-пероксидазы на клетки при комнатной температуре на 30 минут.
8. Замочите стеклянные предметные стекла в PBS на 5 мин 4 раза.
9. Замочите предметные стекла в растворе пероксидазного субстрата, состоящем из 30 мл 50 мМ Tris-HCl, pH7,5, содержащего полный микрошпатель из 3,3'-диаминобензидина тетрагидрихлорида (DAB), и 0,002% (v/v) H₂O₂ в течение 30 с.
10. Повторяйте вышеописанный шаг до тех пор, пока апоптотические клетки не окрашиваются в коричневый цвет. Замочите стеклянные предметные стекла в воде, чтобы остановить реакцию пероксидазы.
11. Окуните клетки в воду для наблюдения.

3. Измеряем уровень фагоцитоза апоптотических клеток

1. Рассмотрите образцы под световым микроскопом с целью оценки уровня фагоцитоза. Подсчитывайте крокеморт-положительные клетки или GFP-положительные клетки как гемоциты, TUNEL-положительные клетки как апоптотические клетки, а двойные положительные клетки как фагоцитирующие гемоциты.
2. Фагоцитарный индекс определяется как количество двойных положительных клеток к общему числу Крокеморт-положительных клеток или GFP-положительных клеток. Рекомендуется наблюдать более 300 гемоцитов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Цельная сыворотка для свиней	MP Biomedicals	No 55993	Для блокировки
Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP	КПЛ	475-1612	вторичное антитело к окрашиванию гемоцитов антителом анти-Крокеморта
5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат	Рош	11383221001	BCIP, Для окрашивания гемоцитов
Нитро синий тетразолиум	Рош	11383213001	NBT, Для окрашивания гемоцитов
Антитела против Крокеморта			описан ранее в Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Набор для обнаружения апоптоза Apop Tag in situ	Многородность	С7100	Для окрашивания апоптоитных клеток. Этот набор включает в себя буфер для уравновешивания, буфер для реакции, буфер STOP/Wash, фермент TdT и анти-дигоксигенин-пероксидазу.
3,3'-диаминобензидина тетрагидрихлорид	Накалай Теске	11009-41	DAB, Для окрашивания апоптоитных клеток

гг.