Анализ эффероцитоза фиксированных клеток: метод изучения эффероцитарного поглощения апоптотических клеток макрофагами с помощью флуоресцентной микроскопии

Аннотация

Источник: Taruc, K., et al. Количественная оценка эффероцитоза с помощью флуоресцентной микроскопии одиночных клеток. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео мы демонстрируем анализ эффероцитоза для изучения клиренса апоптотических клеток с помощью конфокальной микроскопии. Эффероцитоз — это многоступенчатый процесс, при котором апоптотические клетки поглощаются фагоцитами и разлагаются в везикулах, называемых эфферосомами. Этот протокол обеспечивает метод визуализации интернализованных и неинтернализованных частей отдельных апоптотических клеток и количественной оценки эффероцитоза.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Культивирование и получение линии моноцитарных клеток THP-1

1. Культивируйте моноциты THP-1 в качестве суспензионной культуры в колбах T25 при 37 °C + 5%_CO2. Клетки должны быть выращены в 5 мл Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS).
2. Каждый день равномерно подвешивайте клетки по всей питательной среде, осторожно встряхивая колбу, затем немедленно подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра. Клетки должны быть пропущены, как только плотность клеток достигнет 1 x 10⁶ клеток/мл:
   1. Предварительно подогрейте RPMI 1640 + 10% FBS на водяной бане 37 °C.
   2. Перенесите 2 x 10⁵ клеток в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл или коническую пробирку объемом 15 мл, а гранулированные ячейки центрифугируйте при температуре 500 x g при комнатной температуре в течение 5 минут.
   3. Удалите надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу, и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл (микроцентрифужная пробирка объемом 1,5 мл) или 5 мл (коническая пробирка 15 мл) фосфатно-солевого буфера (PBS).
   4. Центрифугируйте пробирку при давлении 500 x g при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите PBS, не повреждая клеточную гранулу.
   5. Суспендируйте гранулу в 1 мл свежего RPMI 1640 + 10% FBS.
   6. В новую колбу Т25 поместите 4 мл подогретого материала, и к этому добавьте ресуспендированные элементы из 1.2.5. Культивируйте в инкубаторе с температурой 37 °C + 5%_CO2 до тех пор, пока клетки не потребуют пассирования (обычно 3 дня) или до тех пор, пока клетки не потребуются для эксперимента.
3. Для эксперимента с макрофагами, полученными из THP-1, удалите необходимое количество клеток из колбы и планшета перед сдачей:
   1. Поместите необходимое количество круглых стеклянных покровных колпачков диаметром 18 мм (толщина #1,5) в лунки 12-луночного планшета — обычно 1 покровное стекло на условие и/или временную точку. В каждую лунку аликвотируется 5 х 10^{по 4} моноцита THP-1. При необходимости количество ячеек, добавляемых в каждую лунку, может быть изменено.
   2. Доведите общий объем каждой ячейки-содержащей лунки до 1 мл с помощью RPMI + 10% FBS, нагретого до 37 °С.
   3. Добавьте 100 нМ форбола 12-миристат13-ацетата (PMA) в каждую лунку и культивируйте в течение 3 дней, чтобы индуцировать дифференцировку моноцитов THP-1 в макрофагоподобные клетки.

2. Культивирование и получение клеточной линии макрофагов J774.2

1. Культивировать клетки J774.2 в колбах T25 при 37 °C + 5%_CO2. Клетки следует выращивать в 5 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) + 10% FBS и пропускать после того, как культура достигнет 80-90% конфлюенции. Для прохождения ячеек:
   1. Удалите все среды из колбы и поднимите один раз с 5 мл PBS.
   2. Выньте PBS из колбы и замените 5 мл свежего DMEM + 10% FBS.
   3. С помощью скребка для клеток соскребите дно колбы, чтобы подвесить клетки в среде. Энергично пипетируйте клетки несколько раз, чтобы разрушить любые клеточные агрегаты.
   4. Разбавьте клетки в соотношении 1:5, удалив 4 мл клеточной суспензии из колбы и заменив ее 4 мл свежей среды. Оставшаяся клеточная суспензия может быть отброшена, использована для запуска новой клеточной культуры в свежей колбе T25 или использована для эксперимента.
2. Чтобы подготовиться к анализу эффероцитоза с использованием клеток J774.2:
   1. За сутки до начала эксперимента суспендируйте клетки J774.2 в 5 мл свежей среды в соответствии с шагами 1.1.1–1.1.3. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и подготовьте необходимый объем клеток в концентрации 5 х 10 4 клеток/мл.
   2. Поместите необходимое количество круглых стеклянных покровных стекол диаметром 18 мм (толщина #1,5) в лунки 12-луночной пластины. В каждую лунку аликвотируется 1 мл из 5 х 10 4 клеток/мл клеточной суспензии.
   3. Культивируйте в течение ночи, чтобы клетки могли прилипнуть к покровному стеклу и восстановиться после пассирования.

3. Культура первичных М2-макрофагов человека

1. Соберите 10 мл гепаринизированной крови человека на каждую необходимую 12-луночную пластину М2-макрофагов.
2. В центрифужную пробирку объемом 15 мл нанесите слой 5 мл человеческой крови поверх 5 мл предварительно нагретой среды для разделения лимфолит-поликлеток. Подготовьте несколько пробирок при обработке >5 мл крови, а не используйте пробирки большего объема.
3. Центрифугируйте при 300 x g в течение 35 минут, используя среднее ускорение и без перерыва.
4. Осторожно снимите верхнюю полосу, богатую мононуклеарными клетками, с помощью пластиковой пипетки и переложите в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Если на шаге 3.2 было подготовлено несколько пробирок, полосы можно объединить в одну пробирку объемом 50 мл. Доведите объем пробирки до 50 мл с помощью PBS.
5. Центрифугируйте при 300 х г в течение 8 минут и удалите надосадочную жидкость. На этом этапе в каждую лунку 12-луночного планшета поместите автоклавные круглые покровные стекла диаметром 18 мм (толщина #1,5).
6. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 300 мкл бессывороточного RPMI 1640 на нужное количество лунок; Например, если 10 мл крови обрабатывали для получения полного 12-луночного планшета, суспензируют клеточную гранулу в 3,6 мл среды.
7. Добавьте 300 мкл клеточной суспензии в каждую лунку, содержащую покровное стекло, в 12-луночном планшете. Выдерживать в течение 1 ч при 37 °C + 5% CO₂.
8. Аккуратно промойте покровное стекло 3 раза 1 мл подогретого PBS, чтобы удалить все неадгезивные клетки.
9. Добавьте 1 мл RPMI 1640 + 10% FBS + 10 нг/мл рекомбинантного человеческого M-CSF + антибиотик/антимикотик клеточной культуры. Выдерживать при 37 °C + 5% CO₂ в течение 5 дней.
10. Замените среды на RPMI 1640 + 10% FBS + 10 нг/мл рекомбинантный M-CSF человека + 10 нг/мл рекомбинантный человеческий IL-4 + антибиотик/антимикотик клеточной культуры. Инкубировать при 37 °C + 5%_CO2 в течение 2 дней до полной поляризации M2.
11. Поляризованные макрофаги следует использовать в течение следующих 3 дней.

4. Получение апоптотических клеток Jurkat

1. Культуру клеток Jurkat в 5 мл RPMI 1640 + 10% FBS при 37 °C + 5% CO₂. Джуркаты представляют собой суспензию клеточной линии и могут поддерживаться путем введения 1:5 в свежую, предварительно подогретую среду каждые 3–5 дней.
2. Для приготовления апоптотических клеток дайте культуре Юрката вырасти до высокой плотности (через 4–5 дней после пассирования). Аликвоту 1,5 мл в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и грануляционные ячейки путем центрифугирования при 500 х г в течение 5 мин.
3. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл бессывороточной среды RPMI 1640, содержащей 1 мкМ ставроспорин.
4. Инкубировать в течение 16 ч при 37 °C + 5% CO₂ для разведения клеток в апоптотический процесс.
5. При желании подтвердите индукцию апоптоза окрашиванием Аннексином V:
   1. Аликвота 100 мкл обработанной ставроспорином клеточной культуры Jurkat в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Грануляторы центрифугированием при 500 x g в течение 5 мин отбрасывают надосадочную жидкость и повторно суспендируют клеточные гранулы в 100 мкл бессывороточной среды RPMI 1640.
   2. Добавьте 1 мкл флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-конъюгированного аннексина V и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте.
   3. Добавьте 900 μL PBS и перенесите весь объем в одну лунку 12-луночного планшета, содержащую круглое стеклянное покровное стекло диаметром 18 мм (толщина #1,5). Отжим в центрифуге, оснащенной адаптером для планшетов, при давлении 200 x g в течение 1 мин, чтобы заставить клетки прилипнуть к покровному стеклу. В качестве альтернативы клетки могут быть помещены в предметное стекло с камерой для визуализации.
   4. Изображение с помощью флуоресцентного микроскопа.

5. Количественная оценка эффероцитарного поглощения и динамики с использованием анализа эффероцитоза с фиксированными клетками и окрашивания изнутри наружу

1. Подготовьте человеческие макрофаги THP-1, J774.2 или M2, как описано в разделах 1-3 соответственно.
2. Вечером накануне начала эксперимента приготовьте апоптотические клетки Jurkat, как описано в разделе 4.
3. Непосредственно перед экспериментом подсчитайте апоптотические клетки с помощью гемоцитометра. Перенесите достаточное количество апоптотических клеток в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл – обычно мы добавляем 5 x 10⁵ клеток/лунку, обеспечивая соотношение мишени и эффероцитов 10:1.
4. Пеллеты Jurkat клетки методом центрифугирования при 500 х г в течение 5 мин и ресуспендирования в 500 мкл PBS.
5. Во время центрифугирования добавьте 10 мкл ДМСО в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Растворите в ДМСО минимальное количество N-гидроксисукцинимимидобиотина (NHS-биотин). Достаточно 5-10 кристаллов (~0,005 мг).
6. Перенесите 500 мкл суспензии апоптотических клеток/PBS в пробирку, содержащую DMSO/NHS-биотин. Затем разбавьте в суспензию апоптотических клеток краситель для отслеживания клеток до рекомендованной производителем концентрации. Убедитесь, что выбран краситель для слежения за клетками, который не перекрывается спектрально с FITC-стрептавидином (например, красный или дальний красный краситель для слежения за клетками).
7. Выдерживать суспензию в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте. Добавьте равный объем RPMI 1640 + 10% FBS и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре в темноте, чтобы погасить любой непрореагировавший краситель.
8. Гранулированные клетки центрифугированием при 500 x g в течение 5 мин отбрасывают надосадочную жидкость и повторно суспендируют окрашенные апоптотические клетки в 100 мкл RPMI 1640 + 10% FBS на лунку макрофагов.
9. Добавьте по 100 мкл окрашенной суспензии апоптотических клеток по каплям в каждую лунку макрофагов. Центрифугируйте 200 x g в течение 1 мин в центрифуге, оснащенной пластинчатым адаптером для принудительного контакта между макрофагами и апоптотическими клетками.
10. Инкубируйте планшет в течение нужного периода времени при 37 °C + 5%_CO2 в инкубаторе для тканевых культур. Для макрофагов эффероцитированный материал обычно впервые обнаруживается через 20–30 мин, а завершается через 120–180 мин.
11. В нужный момент времени извлеките клетки из инкубатора. Дважды промойте клетки 1 мл PBS комнатной температуры, чтобы остановить эффероцитоз и удалить неэффероцитированные апоптотические клетки.
12. Добавьте в каждую лунку конъюгированный с FITC стрептавидин в соотношении 1:1000 и инкубируйте в течение 20 минут в темноте. Это пометит подвергшегося воздействию биотин на любом неэффероцитированном материале апоптотических клеток.
    заметка: При желании ядра клеток могут быть окрашены на этой стадии путем добавления разведения Hoechst 33342 в соотношении 1:2000 или 4',6-диамидино-2-фенилиндола, дигидрохлорида (DAPI).
13. Промойте ячейки 3 раза 1 мл PBS, осторожно встряхивая или покачивая образцы в течение 5 минут за полоскание. Зафиксировать клетки с 4% параформальдегидом (PFA) в PBS на 20 мин при комнатной температуре. Один раз промойте клетки PBS, чтобы удалить излишки PFA.
14. Закрепите покровные стекла на предметном стекле для визуализации и переноса на флуоресцентный микроскоп. Захват z-стеков достаточного количества ячеек для точной количественной оценки — обычно 10–30 ячеек на условие. Неинтернализованный апоптотический клеточный материал будет виден на результирующем изображении в виде материала, помеченного краителем, помеченным FITC-стрептавидином, в то время как эффероцитированный материал образует дискретный клеточный краситель puncta, свободный от какого-либо окрашивания стрептавидином.
15. Количественно оцените эффероцитоз на полученных изображениях с помощью различных показателей:
    1. Рассчитайте эффероцитарный индекс путем определения среднего числа дискретных эфферосом (краситель для отслеживания клеток+/стрептавидин-пункт) на макрофаг. Количественно оценивайте только макрофаги, связанные с апоптотической клеткой или содержащие ≥1 видимых эфферосом. Запись макрофагов, связанных с апоптотической клеткой, но не имеющих дискретных эфферосом, как имеющих эффероцитарный индекс 0.
    2. Рассчитайте эффероцитарную эффективность, измерив долю макрофагов, содержащих ≥1 эфферосому.
    3. Рассчитайте скорость эффероцитоза путем визуализации неподвижных и окрашенных клеток в несколько временных точек. Изображения только макрофагов, связанных с апоптотическими клетками или содержащих видимые эфферосомы, с захватом z-стеков каждой клетки. После визуализации определите частоту эффероцитоза:
       1. Используя в качестве ориентира окрашивание стрептавидином и инструмент выделения от руки или многоугольник в FIJI/ImageJ (или другом программном пакете для анализа изображений), обведите весь материал с краителем для отслеживания клеток+/стрептавидин- (например, интернализованным) в одной плоскости z-стека. Измерьте интегральную интенсивность красителя, отслеживающего клетку, в этой области. Индивидуальные измерения для каждой эфферосомы (например, диаметр, положение относительно границы клетки или ядра и т. д.) могут быть легко получены одновременно с этими измерениями, что значительно увеличивает объем данных, собираемых во время анализа.
       2. На том же z-срезе, используя окрашивание стрептавидина в качестве ориентира и инструмент для произвольного или многоугольного выделения, обведите весь материал для отслеживания клеток: краситель+/стрептавидин+ (например, неинтернализованный) в одной плоскости z-стека. Включайте только окрашивание из апоптотических клеток, контактирующих с фагоцитом. Измерьте интегральную интенсивность этой области.
       3. Повторите шаги с 4.2.3.1 по 4.2.3.2 для остальных z-сечений изображения. Суммируйте интегральную интенсивность эффероцитированных (Σ_eff) и неэффероцитированных (Σ_ne) материалов. Фракция апоптотической клетки, которая была эффероцитирована, может быть рассчитана для клетки следующим образом:
          
       4. Количественно оцените фракцию, эффероцитированную для всех клеток во все моменты времени. Обратите внимание, что интенсивность флуоресценции апоптотических клеток/эфферосом может варьироваться между изображениями из-за различий в поглощении клеточных красителей отдельными апоптотическими клетками, а также из-за изменений в параметрах получения изображений, таких как время экспозиции. Таким образом, сравнивайте только нормализованные значения, такие как эффероцитированная фракция, или независимые от интенсивности значения, такие как эффероцитарный индекс и эффективность эффероцитов, между изображениями, между экспериментальными условиями и между повторными экспериментами.
    4. Чтобы убедиться, что полученный набор данных точно отражает различия в эффероцитозе между клетками, проведите эти анализы на максимальном количестве клеток, возможном в каждом эксперименте><. заметка: Эффероцитарная эффективность и эффероцитарный индекс могут быть рассчитаны быстро (несколько секунд на ячейку), и обычно мы стремимся анализировать не менее 100 клеток в каждом эксперименте, повторяя каждый эксперимент не менее 3 раз. Расчет доли эффероцитированного материала и специфические для эфферосом измерения являются более трудоемкими и обычно занимают 2–3 минуты на клетку для опытного аналитика. Для этих расчетов мы количественно определяем минимум 15 клеток в одном условии в одном эксперименте.
    5. Запишите эффероцитарный индекс, фракцию эффероцитов и данные об отдельных эфферосомах для каждой клетки.
       заметка: Это позволяет анализировать данные с использованием подходов с использованием одноклеточных подходов, что позволяет количественно оценить межклеточные вариации. Анализ на уровне популяции все еще может быть проведен на этих наборах данных путем усреднения данных об отдельных клетках, полученных в отдельных экспериментах. Эфферосомно-специфические измерения могут быть проанализированы на популяционном уровне, на уровне отдельных клеток и в виде ансамблей (например, как популяции эфферосом, независимые от клеток, их содержащих).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
RPMI 1640 Мультимедийное средство	зубр	3500-000-ЭЛ
DMEM Медиа	зубр	319-005-CL
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	зубр	080-150
ПБС	зубр	311-010-КЛ
Круглые стеклянные покровные стекла 18 мм #1.5 толщина	Науки электронной микроскопии	72290-08	Размер и форма покровного стекла не критичны, но 18 мм помещаются в лунки стандартного 12-луночного планшета, что упрощает культивирование клеток
Ставроспорин	Кайман Кемикал	No 81590	Растворение в ДМСО при 1 мМ (1 000x стоковый раствор)
Аннексин V-Alexa 488	ТермоФишер	Р37174
EZ-Link NHS-Биотин	ТермоФишер	20217	Хранить в эксикаторе. Не готовьте стоковый раствор.
Дмсо	Сигма-Олдрич	Д2650
CellTrace FarRed	ТермоФишер	С34572
CellTrace Оранжевый	ТермоФишер	С34851
Hoescht 33342	ТермоФишер	62249
ФИТК-стрептададин	ТермоФишер	СА1001
Среда для сепрации лимфолит-поликлеточных	Лаборатория Седарлейн	КЛ5071
Рекомбинантный М-КСФ человека	Пепротех	200-04
Рекомбинантный человеческий IL-4	Пепротех	300-25
J774.2 Клеточная линия макрофагов	Сигма-Олдрич	85011428-1ВЛ
THP-1 Клеточная линия моноцитов человека	АТКС	ТИБ-202
Т-клеточная линия Юркат	АТКС	ТИБ-152