Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка среды
- Добавьте все компоненты, как описано в таблице 1, чтобы получить базовую среду для сбора ооцитов и среду для созревания ооцитов. Для основной среды сбора установите pH на 7,4. Как для сбора, так и для среды созревания добавьте 3 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 1 мкМ цилостамида в день использования.
2. Получение мРНК, кодирующей Ypet-3' UTR и mCherry
- Получить 3'-последовательности UTR интересующих мРНК><.
заметка: Для этого исследования ранее были получены последовательности из кДНК ооцитов мыши.
- Разрабатывайте праймеры для амплификации целевых 3' UTR из кДНК ооцитов и участков вектора pcDNA 3.1, содержащих кодирующую последовательность Ypet, V5-эпитопную метку и промотор T7.
- Амплифицируйте с помощью высокоточного набора ДНК-полимеразы. Запустите продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) на геле, чтобы проверить, имеют ли фрагменты правильный размер, вырежьте полосы и извлеките ДНК из геля с помощью набора для экстракции геля в соответствии с инструкциями производителя.
- Соедините фрагменты ПЦР с вектором с помощью набора для клонирования ПЦР.
заметка: Фрагменты ПЦР инкубировали на льду в течение 4 ч для обеспечения более эффективного процесса рекомбинации. Это противоречит инструкциям производителя, которые рекомендуют время инкубации всего 45 минут.
- Трансфектируйте фрагменты ПЦР в компетентные бактерии 5-α Escherichia coli.
- Добавьте смесь и плазмиды к бактериям и инкубируйте на льду в течение 30 минут.
- Подвергнуть смесь тепловому удару и плазмиду, поместив смесь на водяную баню при температуре 42 °C на 45 с, и немедленно охладить на льду в течение 3 минут.
- Добавьте 500 μL бульона Super Optimal со средой для подавления катаболитов (SOC) и инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C.
- Уменьшите до 7000 × г в течение 2 минут и удалите большую часть надосадочной жидкости. Ресуспендируйте и наложите на агаровую тарелку бульона Лурия (LB) с соответствующим антибиотиком для подбора.
заметка: В этом исследовании использовался карбенициллин.
- Инкубируйте в течение ночи при 37 °C. Изолируйте колонии, слегка надавливая на наконечник пипетки на одну из колоний и помещая его в 3 мл LB среды со 100 мкг/мл карбенициллина. Выдерживать в течение 12-24 часов при 37 °C.
- Извлеките ДНК плазмид с помощью набора для выделения плазмидной ДНК в соответствии с инструкциями производителя и подтвердите последовательности с помощью секвенирования ДНК.
- Для Ypet/3' UTR:
- Создание линейной ПЦР-матрицы для транскрипции in vitro. Используйте прямой праймер перед последовательностью Ypet и обратный праймер с 20 дополнительными остатками тимина. В таблице 2 приведена последовательность Ypet/IL-7 3' UTR и последовательности прямого и обратного праймеров.
заметка: Эти дополнительные остатки тимина добавят олиго(А) к линейной мРНК после транскрипции in vitro.
- Транскрибируйте продукт ПЦР in vitro с помощью набора для транскрипции Т7 в соответствии с инструкциями производителя.
- Очистите полученную комплементарную РНК (кРНК) с помощью набора для очистки транскрипции в соответствии с инструкциями производителя.
- Разбавьте очищенную кРНК в воде, не содержащей РНКазы, измерьте концентрацию и оцените целостность с помощью агарозного электрофореза. Хранить при температуре −80 °C.
- Для mCherry:
- Создайте линейный шаблон ПЦР для транскрипции in vitro с использованием фермента рестрикции высокой точности; используйте фермент рестрикции mfEI-HF при воспроизведении этого примера. Переварить в буфере для сбраживания в течение ночи при температуре 37 °C.
- Запустите гель для очистки образца и извлеките линейную ДНК с помощью набора для экстракции геля в соответствии с инструкциями производителя.
- Транскрибируйте продукт ПЦР in vitro с помощью набора для транскрипции Т7 в соответствии с инструкциями производителя.
- Полиаденилирование кРНК (150-200 нуклеотидов) с помощью поли(А) хвостового набора в соответствии с инструкциями производителя.
- Очистите полученную кРНК с помощью набора для очистки транскрипции в соответствии с инструкциями производителя.
- Разбавьте очищенную кРНК в воде, не содержащей РНКазы, измерьте концентрацию мРНК и оцените целостность сообщения с помощью гель-электрофореза. Хранить при температуре −80 °C.
3. Экспериментальная процедура
ПРИМЕЧАНИЕ: Схематический обзор микроинъекции ооцитов и последующей покадровой микроскопии приведен на рисунке 1.
- День 1
- Внутрибрюшинное введение 21-дневным мышам 5 МЕ гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы, чтобы стимулировать рост фолликулов до антральной стадии.
- День 3
- Сбор ооцитов
- Осторожно вскройте антральные фолликулы, сделав небольшой надрез в стенке фолликула иглой 26 G. Выделите интактные ооциты (КОК), заключенные в кумулюсную окулюс, с несколькими слоями кумулюсных клеток с помощью стеклянной пипетки, управляемой ртом.
- Используйте пипетку меньшего размера (немного больше диаметра ооцита) и механически удаляйте КОК путем повторного пипетирования.
заметка: В качестве альтернативы можно провести микроинъекцию неповрежденных КОК.
- С помощью пипетки большего размера аспирируйте оголенные ооциты и поместите их в чашку Петри со средой для созревания, дополненной 1 мкМ ингибитора фосфодиэстеразы, цилостамида, чтобы предотвратить возобновление мейотического созревания. Поместите чашку в инкубатор на 2 часа, чтобы дать ооцитам восстановиться от стресса, вызванного выделением ооцитов из фолликулов.
- Микроинъекция ооцитов
- Подготовьте иглы для инъекций, поместив капиллярную трубку из боросиликатного стекла длиной 10 см в механический пуллер. Для оптимальной инъекции согните кончик иглы под углом 45° с помощью нагретой нити.
- Приготовьте полистирольную посуду с каплями 20 мкл основной среды для сбора ооцитов и покройте капли легким минеральным маслом.
- Приготовьте репортерную смесь, добавив 12,5 мкг/мкл Ypet-3' UTR и 12,5 мкг/мкл mCherry. Подготовьте больший объем и сделайте аликвоты для будущих экспериментов, чтобы обеспечить аналогичные концентрации репортера. Храните эти аликвоты при температуре -80 °C. После размораживания сначала центрифугируйте аликвоту в течение 2 минут при 20 000 x g и переложите в новую микроцентрифужную пробирку><.
заметка: Такое центрифугирование предотвратит засорение инъекционной иглы потенциальными заполнителями в смеси репортера.
- Загрузите в инъекционную иглу по капиллярности примерно 0,5 мкл репортерной смеси.
- Поместите держатель пипетки и заряженную иглу для инъекций в держатели и поместите в каплю среды для сбора ооцитов. Внесите часть среды в пипетку.
- Откройте иглу для инъекций, осторожно постучав ею по удерживающей пипетке.
- Поместите ооциты в каплю основной среды для сбора и введите 5-10 мл репортерной смеси.
- Инкубируйте ооциты в среде созревания с 1 мкМ цилостамидом в течение 16 ч, чтобы сигнал mCherry стабилизировался.
- Приготовьте чашку Петри, которая будет использоваться для покадровой микроскопии с не менее чем двумя каплями по 20 мкл среды созревания для каждого введенного репортера: одна капля с 1 мкМ цилостамидом для контроля профазы I-задержанных ооцитов и одна капля без цилостамида для созревающих ооцитов. Залейте капельки легким минеральным маслом и поместите в инкубатор.
- Интервальная микроскопия
- После предварительной инкубации введенные ооциты извлечь из инкубатора, и четыре раза промыть их в среде созревания без цилостамида. Некоторые ооциты содержат в среде созревания с 1 мкМ цилостамидом в качестве контрольной группы ооцитов, задержанных профазой I.
- Перенесите введенные ооциты в соответствующие капли на заранее подготовленной чашке для покадровой съемки микроскопа. Кластеризуйте ооциты с помощью закрытой стеклянной пипетки (закрытую пипетку можно приготовить, удерживая наконечник в пламени в течение нескольких секунд).
заметка: Кластеризация ооцитов помогает предотвратить их движение во время записи.
- Поместите чашку под микроскоп, оснащенный светодиодной системой освещения, и моторизованный столик с климатической камерой, поддерживаемой на уровне 37 °C и 5%CO2. Чтобы повторить это исследование, используйте следующие параметры: набор фильтров: дихроичное зеркало YFP/CFP/mCherry 69008BS; Канал YFP (Возбуждение (Ex): S500/20 × 49057; Излучение (ЭМ): D535/30 m 47281), канал mCherry (Пример: 580/25 × 49829; Em: 632/60 м).
- Введите соответствующие настройки для эксперимента с интервальной съемкой (см. Таблицу материалов для программного обеспечения, используемого в этом исследовании): Нажмите на Приложения | Многомерное приобретение. Выберите первую вкладку «Главная» и выберите таймлапс, несколько позиций сцены и несколько длин волн.
- Выберите вкладку Сохранение, чтобы указать местоположение, в котором должен быть сохранен эксперимент.
- Выберите вкладку Таймлапс, чтобы ввести количество временных точек, продолжительность и временной интервал.
заметка: Продолжительность покадрового эксперимента зависит от изучаемого вида животных, так как сроки мейотического созревания ооцитов различаются у разных видов. В этом эксперименте с ооцитами мышей ооциты регистрировались каждые 15 мин в течение 16 ч.
- Выберите вкладку Stage. Включите светлое поле и определите положение ооцитов, открыв новое окно, выбрав «Захватить» | Приобретение | Шоу в прямом эфире. Как только ооциты будут найдены, переключитесь обратно в окно «Многомерное сканирование» и нажмите +, чтобы задать местоположение ооцитов.
- Выберите вкладку Длины волн и установите 3 разные длины волн для brightfield (экспозиция 15 мс), YFP (экспозиция 150 мс для Ypet/IL7 3' UTR) и mCherry (экспозиция 75 мс для Ypet/IL7 3' UTR).
заметка: Отрегулируйте экспозицию для каждого репортера Ypet/3' UTR в зависимости от уровня накопления репортера и введенного объема. Убедитесь, что сигнал YFP попадает в центр диапазона обнаружения в начале эксперимента, чтобы предотвратить недооценку или насыщение в случае активации трансляции. Для mCherry корректируйте экспозицию для каждой партии mCherry, так как сигнал зависит от количества нуклеотидов аденина, которые были добавлены во время процедуры полиаденилирования. Из-за различий в эффективности полиаденилирования используйте одну и ту же партию mCherry в разных экспериментах для лучшего сравнения между экспериментами.
- Запустите эксперимент с интервальной съемкой, нажав кнопку «Получить». На рисунке 1 приведен пример покадровой записи в одном ооците.
- Анализ трансляции UTR Ypet-3
- Для этого анализа (см. Таблицу материалов для программного обеспечения, используемого в этом исследовании) выполните два измерения области для каждой ооциты: сама ооцит - щелкните по области эллипса и окружите ооцит - и небольшая область, близкая к ооциту, которая будет использоваться для вычитания фона - щелкните по прямоугольной области.
заметка: Следите за тем, чтобы ооциты не выходили из выбранной области во время цейтраферной записи. Обратите особое внимание на размещение измерения области вокруг экструзии полярного тела, так как это вызывает движение в ооците и может исказить запись.
- Экспортируйте данные измерений региона в электронную таблицу, нажав сначала «Открыть журнал», а затем «Данные журнала», чтобы экспортировать программное обеспечение для анализа данных.
- Для каждого отдельного ооцита и для всех измеренных временных точек вычтите измеренную фоновую область из измерения области ооцита. Сделайте это отдельно для длин волн YFP и mCherry.
Таблица 1: Подготовка среды. Перечень компонентов, которые необходимо добавить для приготовления основной среды для сбора ооцитов и среды для созревания ооцитов.
| Основная среда для сбора ооцитов | |
| компонент | Для 500 мл |
| HEPES модифицированный Minimum Essential Medium Eagle | 7,1 г |
| Бикарбонат натрия | 252 мг |
| Пируват натрия | 1,15 мл |
| Пенициллин/стрептомицин 100x | 5 мл |
| Сверхчистая дистиллированная вода (Invitrogen, 10977-015) | До 500 мл |
| Среда созревания | |
| компонент | Для 500 мл |
| MEM alpha 1x | До 500 мл |
| Пируват натрия | 1,15 мл |
| Пенициллин/стрептомицин 100x | 5 мл |
Таблица 2: Пример последовательности репортера и праймера Последовательность репортера YFP/IL7 3'UTR и последовательности прямых и обратных праймеров, которые были использованы для создания линейной ПЦР-матрицы для транскрипции in vitro.
| последовательность |
| Ypet/Interleukin-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACCGGGGCACCATGGAGCAAAGGCGAAGAGCTGTTCACC
GGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGTGAACGGCAAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGCGAGGCGAGGCGCGACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGCTGCTGCTGCTGCACCACCGGCAAGCTG
CCCGTGCCCTGGCCCCTGGTGACCCTGACCCTGGGCGGCGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGACCCCGACCGACCGACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGAGCCCATGCCCGAGGCTACGTGCAGGAGCGGACCA
TCTTCTTCAAGGACGACCAACAAGACCCGGGCCGAGGTGAGTGAGTGAGGGCGACCCTGGTGAACCGTGAACCGGAGGGATCGAGGCATCGACTTCAAGGAGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAG
TACAACTACAACAGCCACAACGTACATCACCGCCGAAGCAGAAGAAGAGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGGCAACATCGAGGCGGCGGCGGCGGCGTGCAGCTGGCACCACCACTACCAGCAGAACCCCA
TCGGCGACGGGGCCGTGCTGCTGCCCGAACCACTACCTGAGCTACCTGAGCAGCGCCCTTCAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTCCTGCCGCCGCCGGCATCACCGAGGGC
ATGAACGAGCTCTATAAGAGATCTTTCGAAGGTAAGCCTATCTAACCCTCTCTCCGGTCTCGATTCTACGGTACCGGTCATCACCATCACCATTGAAGGACATGTAGTAACAACCCAAGAATCTACTGGTT
CATATACTTGGAGAGGTTGAAACCCTTCCAGAAGTTCCTGGATGCCTCCTGCTCAAATAAGCCAAGCAGCTGAGAAATCTACAGTGAGGTATGAGATGGACACAGAAATGCAGCTGACTGCTGCCGTCAGCATATA
CATATAAAGATATATCAACTATACAGATTTTTTTGTAATGCAATCATGTCAACTGCAATGCTTTTTTAAACCGTTCCAAATGTTTTTCTAACACAAAGTCTAAAAAGCAAAGCAAAGCAAAGCAAGGCTATGAAGATTCAGAGTCACCACTGTTTTTTCTT
AGCAAAATGATGGTATGGTTAAACATTCATTGGTGAACCACTGGGGGAGTGGAACTGTCCTTTTTTAGACTGGAGGGGGCTCACGGTGATGGATAATGCTTGAAAAAAGAAGAGTCTATCTTAAAGCAGCAG
CAAAAAGAAGCTTAAGGCACTTAAGGCATCAAAATGTAGTAGTTAATTAAATTAACATAACTTCAGTAAAGAGCATAGCAGATATTTTTAAAAAAGTATTTTTAAAAAATGCACTTATTCCAAAGATACTGA
ACCTTAGTTAGTCAGTCGCTTTTGACACTTGTGTATAATAAAGCTTATATAACTGAATTTTCAATTTGAAAAGTATATTTTTAAAGAATATATGCTAGACTTTTAATTAATATATATTATTATTATTTTTTTTTTGGCATTCTCTGTCTCTCT
CTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACCTATCTATATAATTTTCATATACCAATTGCGTACTTTGGATAGTGTCTCTTTTTAACCTAAATGACCTATTATTAACACTGTCAGGTTCCCTCTCTTCTCGAGAG
TGTTCATTGCTGCACTGTCATTTGATCCCAGTTTTTTTGAACACATATCCTTTAACACTCACACACACACACACACAGTAGGAGACTAGGACCCTATAACTTTTTTAAGAAGAAAACACTTCTTTTTTTTTTTTTATTAGGGTC
TTATTCGTATCTAAGGCAGGCTAGGATTGAGACATGAGCCAATATGCTTAATTAGAAACATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTTAAACTCATGTCTTTTACAAGATGCCTACATATATTATATTATGCCTGTTTTTAAATCCTTTTTTTTTTTTAAGGT
CTGCTGTCTTCCTTCAGTTGTAATGGAAAGAAACACTATGTTGTAGAGGCCAAATTTCTGAAAGTGATAAGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTTACTGAATTCATTCTCTCTCTGTTGCTTTTTTTTTCCAGCCACGTGAGCATCTAGCTATCTATACGCT
GGATGTATTTGACCGATGCCTGCTCCACTGGCACATTGCATGTGGTAGCCATGGTGGTAGCCATGCCTTCTTGCTCTTTTCTCTCTCTCCCCCCCCCTAATGCTACTCAGTGGTACAGATAGCTGGGATTATCAATTTGAGAAAC
ACCAATTGTTTTAAAGTTTTTTTTTCATAATCACCATTTGCCCAGAAAAACAGTTCTCTCAACTTGTTTGCAACATGTAATAATTTAAGAAACTCAATTTTTTTTTTTTTAATGGACTCGATAACTTCCTTAGATCCCACATCTCCTACGT
GTCAGTCCTTTGTCCTGAGGAACTGGTAAAATGGGTAAGCCCTTAGCTAGCGAACTGAAGGCATTCGCATGTGTAAGATAATCTCTATACCTGCAAGGCTGTGTGGATGGCTCCCTACCAATATTGAACAATATTCTGATT
TTGGCAAAAATAAAGGATAATATTTT |
| Передний праймер | GAGAACCCACTGCTTAC |
| Обратный праймер | ТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТГККАААААТК |
