Анализ мониторинга подкисления кишечника: методика изучения подкисления просвета кишечника у дрозофил с использованием бромфенолового синего красителя

Аннотация

Источник: Abu, F., et al. Мониторинг закисления кишечника в кишечнике взрослой дрозофилы. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует анализ для мониторинга закисления кишечника у мух дрозофилы. После приема пищи с добавлением красителя для индикатора pH, подкисление просвета кишечника приводит к изменению цвета красителя. Визуальный осмотр пищеварительного тракта мух для изучения изменения цвета дает признаки закисления.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная лабораторная линия Oregon R использовалась в качестве контроля WT. Всех мух выращивали на стандартной среде из кукурузной муки и патоки (содержащей патоку, агар, дрожжи, кукурузную муку, тегосепт, пропионовую кислоту и воду) при комнатной температуре с 12/12 ч светлым/темновым циркадным ритмом.

1. Подготовка к анализу

1. Соберите самок мух (в возрасте 0-2 дней, недевственниц) под наркозом CO₂ и дайте им восстановиться на стандартном корме из кукурузной муки в течение как минимум 3 дней до экспериментов.
2. Уморите мух голодом в течение ~24 часов при комнатной температуре (~23 °C) во флаконах, содержащих салфетку, смоченную ~2 мл деионизированной воды.
3. Готовят корм для мух с бромфеноловым синим (БББ) следующим образом:
   1. Растопите корм от мух в микроволновой печи, а затем дайте ему остыть, пока он не станет теплым.
   2. Добавьте 1 мл 4% BPB в 1 мл теплой пищи и хорошо перемешайте.
   3. С помощью пипетки добавьте корм для мух, содержащий BPB, в одну точку (~200 мкл) в центре чашки Петри.

2. Анализ мониторинга подкисления кишечника

1. Перенесите истощенных мух в чашку Петри, содержащую отдельные точки (200 мкл) корма для мух с добавлением 2% бромофенолового синего (BPB). Дайте мухам кормиться в течение 4 часов при комнатной температуре под воздействием света.
2. Через 4 ч соберите мух и обезболите их на льду; хирургическим путем изолируйте их кишки.
   1. Проведите операцию в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) с помощью щипцов под стереомикроскопом (см. Таблицу материалов). Изолируйте кишечник, удерживая грудную клетку парой щипцов и опуская брюшную полость второй парой, пока не станет видна CCR кишечника, следя за тем, чтобы кишечник оставался прикрепленным с обоих концов.
3. Определите закисление кишечника, исследуя цвет CCR кишечника (рисунок 1C; желтый указывает на подкисление, а синий — на неподкисленный).
4. Подсчитайте только тех мух, у которых в кишечнике наблюдается сильное окрашивание BPB.
5. Рассчитайте процент по следующей формуле:
   Процент мух с подкисленными кишками = количество мух подкисленных × 100 / (количество подкисленных мух + количество неподкисленных мух)
   заметка: Процент 0 указывает на то, что ни одна муха не подкислила свой кишечник, в то время как процент 100 указывает на то, что все мухи подкислили свой кишечник.

Результаты

Рисунок 1: Мониторинг закисления кишечника.(А) Схематический чертеж кормовой арены. Синяя точка представляет корм для мух с бромфеноловым синим (краситель, указывающий на pH). Другие пятна представляют собой плодовых мушек. (B) Графическое представление процентного соотношения мух с подкислением кишечника, которых кормили в течение 4 часов в течение разной продолжите...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бромфенол синий	Сигма-Олдрич		В0126
D. simulans	Центр популяции видов дрозофил при Калифорнийском университете		Риверсайд Калифорния1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. erecta	Центр популяции видов дрозофил при Калифорнийском университете		Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. pseudoobscura	Центр популяции видов дрозофил при Калифорнийском университете		Юджин, Орегон(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. mojavensis	Центр популяции видов дрозофил при Калифорнийском университете		Шоколадные горы, Калифорния (https://www.drosophilaspecies.com/)
щипцы	Биология иноксов		Каталог# 11252-20
Ким вытирает салфетки	Кимтех
Орегон Р	Bloomington Drosophila Stock		(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
Чашки Петри	Научный центр Фишера		Каталог #FB0875713A
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	ГиКлон		Каталог # SH30258.01
Стереомикроскоп	Olympus SZ51		Визуальное увеличение