$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Реагенты и растворы
- Сделайте 500 мл буфера MS-EGTA для выделения митохондрий: 225 мМ маннитола, 75 мМ сахарозы, 5 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтанасульфоновой кислоты (HEPES), 1 мМ этиленгликоля-бис(β-аминоэтилового эфира)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA), pH отрегулирован до 7,4 с помощью KOH. Стерилизуйте его через фильтр 0,22 мкм и храните при температуре 4 °C. Перед использованием убедитесь, что буфер MS-EGTA предварительно охлажден до 4 °C.
- Приготовьте 100 мл буфера KCl: 125 мМ KCl, 20 мМ HEPES, 1 мМ KH2PO4, 2 мМ MgCl2, 40 мкМ EGTA и отрегулировав pH до 7,2 с помощью KOH. Храните его при комнатной температуре.
- Приготовьте 1 мМ кальция зеленый-5N в виде диметилсульфоксида (ДМСО). Бульчатый зеленый кальций-5N можно аликотировать и хранить при температуре -20 °C.
- Подготовьте субстраты для поглощения Ca2+.
- Приготовьте 1 М пирувата натрия, pH 7,4. Храните его в аликвотах при температуре -20 °C.
- Приготовьте 500 мМ малата, pH 7,4. Храните его в аликвотах при температуре -20 °C.
2. Выделение сердечных митохондрий
- Усыпьте мышь в соответствии с институциональными стандартами.
заметка: Для нашего институционально одобренного метода эвтаназии мышей обезболивали вдыханием изофторана и приносили в жертву из-за вывиха шейки матки.
- Соберите сердце, открыв грудную полость, разрезав по обе стороны от ребер, обойдя сердце с фланга, отрезав диафрагму и исключив сердечную ><ткань.
заметка: В этом протоколе митохондриальная изоляция проводится из цельного сердца, собранного у взрослой мыши (примерно 120 мг), чего должно быть достаточно для 3-4 экспериментов. Для выделения митохондрий из других богатых митохондриями тканей, таких как печень, можно использовать до 200 мг ткани в соответствии с описанным протоколом.
- Тщательно промойте ткань в 25 мл ледяного 1x фосфатно-солевого буфера (PBS), следя за тем, чтобы вся кровь была выдавлена из желудочков.
заметка: Сердце будет достаточно промыто, когда жидкость, выжатая из сердца, станет прозрачной.
- Измельчите сердце на мелкие кусочки в 5 мл ледяного 1x PBS с помощью острых ножниц.
- Выбросьте PBS и перенесите измельченную сердечную ткань в предварительно охлажденный гомогенизатор из стеклотефлона Dounce объемом 7 мл с зазором от 0,10 до 0,15 мм.
- Добавьте 5 мл ледяного буфера MS-EGTA и гомогенизируйте образец до тех пор, пока кусочки ткани не станут видны (примерно 11 ударов).
заметка: Не следует чрезмерно гомогенизировать ткань, так как цель состоит в том, чтобы получить интактные и функциональные митохондрии.
- Переложите гомогенат в пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугируйте гомогенат при 600 x g при 4 °C в течение 5 мин для гранулирования ядер и неразрушенных клеток.
- Перенесите надосадочную жидкость в свежую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте ее при 10 000 x g при 4 °C в течение 10 минут для гранулирования митохондрий.
- Выбросьте надосадочную жидкость и держите митохондриальную гранулу на льду.
- Дважды промойте митохондриальную гранулу с помощью ледяного буфера MS-EGTA. Для каждой промывки ресуспендируйте митохондриальную гранулу в 5 мл буфера MS-EGTA, центрифугируйте ее при 10 000 x g при 4 °C в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
- После окончательного промывки выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте митохондрии в 100 мкл ледяного буфера MS-EGTA. Держите митохондрии на льду.
заметка: Митохондрии следует использовать для экспериментов в течение 1 ч.
- Измерьте концентрацию митохондриального белка с помощью анализа белка Брэдфорда.
3. Измерение поглощения кальция митохондриальными источниками с помощью считывателя планшетов
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описан протокол анализа поглощения митохондриальногоCa2+ с использованием многорежимного считывателя планшетов, оснащенного инжекторами. Может быть использован любой планшетный ридер с возможностью считывания флуоресценции кальциевого зеленого-5N (возбуждение/излучение 506/532 нм) в кинетическом режиме с автоматическими инжекторами реагентов для защиты реакции от света.
- Запрограммируйте считыватель планшетов на выполнение кинетического считывания флуоресценции зеленого кальция-5N с измерениями, проводимыми каждую секунду в течение общего времени анализа 1000 с. Кроме того, запрограммируйте инжекторы реагентов на дозирование 5 мкл раствора CaCl2 в моменты времени 30 с, 150 с, 300 с, 480 с и 690 с><.
заметка: Время введения CaCl2 определяется пользователем и может быть скорректировано в соответствии с экспериментальными потребностями.
- Загрунтуйте инжекторы реагентов раствором CaCl2, который будет использоваться.
заметка: Концентрация раствора CaCl2 определяется пользователем и может быть отрегулирована в последующих прогонах для титрования количества Ca2+, необходимого для запуска MPTP.
- Добавьте 200 мкг митохондрий в индивидуальную лунку 96-луночного планшета.
- Добавьте в лунку соответствующий объем буфера KCl таким образом, чтобы общий объем митохондрий и буфера KCl составил 197 мкл.
- Добавьте 1 мкл 1 мкл 1 М пирувата и 1 мкл 500 мМ малата в смесь митохондрий. Аккуратно перемешайте с пипеткой и инкубируйте митохондрии с субстратами в течение 2 минут при комнатной температуре, чтобы митохондрии активизировались.
- Добавьте 1 мкл 1 мМ кальция зеленого-5N бульона. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
заметка: Защитите реакцию от света после добавления красителя кальциевый зеленый-5N.
- Запустите предварительно запрограммированный кинетический протокол и контролируйте флуоресценцию зеленого кальция-5N.