Анализ поглощения кальция в митохондриях: метод измерения поглощения кальция в изолированных митохондриях, основанный на считывателе планшетов

Аннотация

Источник: Maxwell, J.T., et al., Анализы притока митохондриального кальция в изолированных митохондриях и культивируемых клетках. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает анализ на основе чтения планшетов для измерения поглощения кальция митохондриями в изолированных митохондриях. В ходе анализа анализируется сигнал флуоресценции чувствительного к кальцию флуоресцентного красителя для изучения кинетики поглощения кальция митохондриями и перегрузки кальцием.

Протокол

1. Реагенты и растворы

1. Сделайте 500 мл буфера MS-EGTA для выделения митохондрий: 225 мМ маннитола, 75 мМ сахарозы, 5 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтанасульфоновой кислоты (HEPES), 1 мМ этиленгликоля-бис(β-аминоэтилового эфира)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA), pH отрегулирован до 7,4 с помощью KOH. Стерилизуйте его через фильтр 0,22 мкм и храните при температуре 4 °C. Перед использованием убедитесь, что буфер MS-EGTA предварительно охлажден до 4 °C.
2. Приготовьте 100 мл буфера KCl: 125 мМ KCl, 20 мМ HEPES, 1 мМ KH₂PO₄, 2 мМ MgCl₂, 40 мкМ EGTA и отрегулировав pH до 7,2 с помощью KOH. Храните его при комнатной температуре.
3. Приготовьте 1 мМ кальция зеленый-5N в виде диметилсульфоксида (ДМСО). Бульчатый зеленый кальций-5N можно аликотировать и хранить при температуре -20 °C.
4. Подготовьте субстраты для поглощения Ca²⁺.
   1. Приготовьте 1 М пирувата натрия, pH 7,4. Храните его в аликвотах при температуре -20 °C.
   2. Приготовьте 500 мМ малата, pH 7,4. Храните его в аликвотах при температуре -20 °C.

2. Выделение сердечных митохондрий

1. Усыпьте мышь в соответствии с институциональными стандартами.
   заметка: Для нашего институционально одобренного метода эвтаназии мышей обезболивали вдыханием изофторана и приносили в жертву из-за вывиха шейки матки.
2. Соберите сердце, открыв грудную полость, разрезав по обе стороны от ребер, обойдя сердце с фланга, отрезав диафрагму и исключив сердечную ><ткань. заметка: В этом протоколе митохондриальная изоляция проводится из цельного сердца, собранного у взрослой мыши (примерно 120 мг), чего должно быть достаточно для 3-4 экспериментов. Для выделения митохондрий из других богатых митохондриями тканей, таких как печень, можно использовать до 200 мг ткани в соответствии с описанным протоколом.
3. Тщательно промойте ткань в 25 мл ледяного 1x фосфатно-солевого буфера (PBS), следя за тем, чтобы вся кровь была выдавлена из желудочков.
   заметка: Сердце будет достаточно промыто, когда жидкость, выжатая из сердца, станет прозрачной.
4. Измельчите сердце на мелкие кусочки в 5 мл ледяного 1x PBS с помощью острых ножниц.
5. Выбросьте PBS и перенесите измельченную сердечную ткань в предварительно охлажденный гомогенизатор из стеклотефлона Dounce объемом 7 мл с зазором от 0,10 до 0,15 мм.
6. Добавьте 5 мл ледяного буфера MS-EGTA и гомогенизируйте образец до тех пор, пока кусочки ткани не станут видны (примерно 11 ударов).
   заметка: Не следует чрезмерно гомогенизировать ткань, так как цель состоит в том, чтобы получить интактные и функциональные митохондрии.
7. Переложите гомогенат в пробирку объемом 15 мл.
8. Центрифугируйте гомогенат при 600 x g при 4 °C в течение 5 мин для гранулирования ядер и неразрушенных клеток.
9. Перенесите надосадочную жидкость в свежую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте ее при 10 000 x g при 4 °C в течение 10 минут для гранулирования митохондрий.
10. Выбросьте надосадочную жидкость и держите митохондриальную гранулу на льду.
11. Дважды промойте митохондриальную гранулу с помощью ледяного буфера MS-EGTA. Для каждой промывки ресуспендируйте митохондриальную гранулу в 5 мл буфера MS-EGTA, центрифугируйте ее при 10 000 x g при 4 °C в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
12. После окончательного промывки выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте митохондрии в 100 мкл ледяного буфера MS-EGTA. Держите митохондрии на льду.
    заметка: Митохондрии следует использовать для экспериментов в течение 1 ч.
13. Измерьте концентрацию митохондриального белка с помощью анализа белка Брэдфорда.

3. Измерение поглощения кальция митохондриальными источниками с помощью считывателя планшетов

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описан протокол анализа поглощения митохондриального^Ca2+ с использованием многорежимного считывателя планшетов, оснащенного инжекторами. Может быть использован любой планшетный ридер с возможностью считывания флуоресценции кальциевого зеленого-5N (возбуждение/излучение 506/532 нм) в кинетическом режиме с автоматическими инжекторами реагентов для защиты реакции от света.

1. Запрограммируйте считыватель планшетов на выполнение кинетического считывания флуоресценции зеленого кальция-5N с измерениями, проводимыми каждую секунду в течение общего времени анализа 1000 с. Кроме того, запрограммируйте инжекторы реагентов на дозирование 5 мкл раствора CaCl₂ в моменты времени 30 с, 150 с, 300 с, 480 с и 690 с><. заметка: Время введения CaCl₂ определяется пользователем и может быть скорректировано в соответствии с экспериментальными потребностями.
2. Загрунтуйте инжекторы реагентов раствором CaCl₂, который будет использоваться.
   заметка: Концентрация раствора CaCl₂ определяется пользователем и может быть отрегулирована в последующих прогонах для титрования количества Ca²⁺, необходимого для запуска MPTP.
3. Добавьте 200 мкг митохондрий в индивидуальную лунку 96-луночного планшета.
4. Добавьте в лунку соответствующий объем буфера KCl таким образом, чтобы общий объем митохондрий и буфера KCl составил 197 мкл.
5. Добавьте 1 мкл 1 мкл 1 М пирувата и 1 мкл 500 мМ малата в смесь митохондрий. Аккуратно перемешайте с пипеткой и инкубируйте митохондрии с субстратами в течение 2 минут при комнатной температуре, чтобы митохондрии активизировались.
6. Добавьте 1 мкл 1 мМ кальция зеленого-5N бульона. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
   заметка: Защитите реакцию от света после добавления красителя кальциевый зеленый-5N.
7. Запустите предварительно запрограммированный кинетический протокол и контролируйте флуоресценцию зеленого кальция-5N.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Synergy Neo2 Многорежимный считыватель микропланшетов с инжекторами	Биотек
Тканевый гомогенизатор	Кимбл	886000-0022
96-луночный планшет	Корнинг	No 3628
Кальций зеленый-5N	Инвитроген	С3737
Дмсо	Инвитроген	Д12345
ХЕПЕС	сигма	Н3375
ЭГТА	сигма	Е8145
Хлористый калий	рыбак	БП366-500
Хлорид магния	сигма	М2670
Пируват натрия	сигма	П2256
L-яблочная кислота	сигма	М1125
Хлорид кальция	сигма	С4901
Калийфосфат одноосновной	сигма	П0662