1. Приготовление больших униламеллярных везикул (LUV)
- Подготовьте LUV для использования в качестве имитаторов клеточных мембран для анализа утечки флуоресценции.
- Смешайте со стеклянным шприцем Hamilton фосфатидилхолин (DOPC, 786,11 г/моль), сфингомиелин (SM, 760,22 г/моль) и холестерин (Chol, 386,65 г/моль) в молярном соотношении 4:4:2. Липидный раствор получают из исходного раствора каждого липида, растворенного в растворителе метанол/хлороформ (3/1; объем/объем) в концентрации 25 мг/мл в стеклянной колбе с круглым дном объемом 25 мл. На основе 4 μмоль DOPC, 4 μмоль SM и 2 μмоль Chol, липидный раствор получают из исходного раствора путем смешивания 126 μл, 117 μл и 31 μл соответственно.
осторожность: Метанол является токсичным и легковоспламеняющимся растворителем, а хлороформ токсичен и канцерогенен. Оба должны обрабатываться с соответствующей защитой под капотом.
- Выпарить метанол/хлороформ с помощью ротационного испарителя под вакуумом в течение 45-60 мин при 60 °С до образования высохшей липидной пленки.
- Приготовьте два исходных буферных раствора HEPES. Приготовьте буфер HEPES 1, смешав 20 мМ HEPES (238,3 г/моль) и 75 мМ NaCl (58,44 г/моль) и отрегулируйте pH до 7,4. Приготовьте буфер HEPES 2, смешав 20 мМ HEPES и 145 мМ NaCl, и отрегулируйте pH до 7,4. Буферы HEPES можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 месяца.
заметка: Рекомендуется проверять осмолярность буферов с помощью осмометра.
- Раствор для гидратации липидов готовят путем растворения мембранной непроницаемой пары флуоресцентных красителей-гасителей, 8-аминонафталина-1, 3, 6-трисульфоновой кислоты, динатриевой соли в концентрации 12,5 мМ (ANTS, 427,33 г/моль) и-ксилол-биспиридиния бромида в концентрации 45 мМ (DPX, 422,16 г/моль) в буферном растворе HEPES. Смешивание ANTS с DPX приводит к получению раствора желтого цвета. Для достижения концентраций 12,5 мМ ANTS и 45 мМ DPX растворить 21,4 мг и 76 мг соответственно в 4 мл буфера HEPES 1,
заметка: Раствор для гидратации липидов можно хранить в течение 2 недель при температуре 4 °C, обернув тубу алюминиевой фольгой.
- Восстановите многослойные везикулы (MLV) путем суспендирования высушенной липидной пленки 1 мл раствора для гидратации липидов и вортексирования до растворения высушенной липидной пленки. Убедитесь, что раствор полностью растворен, так как небольшие липидные агрегаты негативно повлияют на предыдущие этапы. Также проверьте стенку стеклянной колбы с круглым дном, чтобы убедиться, что на ней не осталось липидной пленки.
заметка: После солюбилизации раствор станет опалесцирующим и светло-желтым.
- Подвергните везикулы пяти циклам замораживания/размораживания для получения однослойных везикул. Выполняйте каждый цикл, помещая стеклянную колбу с круглым дном на 30 с в жидкий азот для стадии замораживания, затем оставляя ее на водяной бане на 2 минуты для стадии оттаивания.
заметка: Температура воды в ванне должна быть на 5-10°C выше температуры плавления липидов.
- Подготовьте липидный экструдер путем введения двух фильтрующих опор, предварительно увлажненных с помощью буфера HEPES, в каждую деталь экструдера из политетрафторэтилена (ПТФЭ), помещенную в металлическую канистру экструдера.
- Поместите мембрану из увлажненного поликарбоната HEPES (размер пор 0,1 мкм, диаметр 25 мм) поверх одной опоры фильтра.
- Соберите две металлические канистры экструдера и закрутите их.
- Поместите собранный экструдер в держатель и введите шприц объемом 1 мл в соответствующее отверстие на конце каждой части политетрафторэтилена. Экструзия соответствует прохождению тестируемой жидкости из одного шприца в другой через поликарбонатную мембрану.
- Проверьте экструдер с 1 мл буфера HEPES, загруженным в один из шприцев объемом 1 мл, чтобы убедиться в отсутствии утечек или проблем.
- Замените 1 мл буфера HEPES образцом MLV.
- Выполните экструзию путем пропускания образца MLV из одного шприца в другой через поликарбонатную мембрану не менее 21 раза, чтобы получить однородные LUV одинакового размера.
заметка: Экструзия должна производиться при температуре выше температуры плавления липидной смеси.
2. Очистка LUV
- Приготовьте очистку колонны для удаления неинкапсулированных ANTS и излишков DPX.
- Ввели сшитый гель декстрана (G-50), ресуспендированный в водной среде с 0,01% NaN3 (65 г/моль) в колонку жидкостной хроматографии (Luer Lock, без оболочки, 1,0 см х 20 см, объем слоя 16 мл) на глубине до 1 см ниже верха бесцветной части колонки.
- Откройте кран и дайте жидкости стечь, чтобы осесть сшитый гель декстрана.
- Промойте колонку, нанеся 20 мл буфера HEPES 2, и выбросьте выходной поток колонки.
- Закройте кран, как только мертвый объем растворителя над колонкой будет сведен к минимуму (<100 μл), но достаточным для предотвращения высыхания сшитого геля-декстрана.
- Поместите только что экструдированные LUV (желтые) на колонку и дайте им войти в гель сшитого декстрана.
- Непрерывно добавляйте в колонку буфер HEPES 2 для проведения очистки LUV.
- Разбавьте примерно 2 мл буфера HEPES 2 (не забывайте регулярно заполнять верхнюю часть колонки, чтобы избежать высыхания геля сшитого декстрана): свободный желтый раствор ANTS и DPX мигрирует медленнее, чем липосомы.
- Начните собирать очищенные LUV в пробирки (1,5 мл).
- Наблюдайте за каплями элюента из колонки, и когда они становятся опалесцирующими, они содержат липосомы. Поменяйте пробирку, чтобы восстановить фракцию, содержащую LUV.
- Разводите до тех пор, пока капли не перестанут перерастать (~1 мл). После этого разбавьте еще 0,5 мл в отдельной фракции, а затем прекратите элюирование.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандарты в настоящее время доступны в широком диапазоне молекулярных масс, в виде наборов или отдельных молекулярных масс для калибровки объема элюирования LUV.
- Оберните тюбики с LUV алюминиевой фольгой, чтобы избежать отбеливания флуоресцентного красителя.
- Промойте колонку 20 мл буфера HEPES 2.
- Затем LUV могут храниться в течение недели при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку стабильность LUV может зависеть от концентрации и состава LUV, а также от ионной силы, размер LUV следует контролировать с помощью прибора для динамического рассеяния света (DLS) (см. раздел 4). Определение размера и однородности LUV) перед каждым испытанием.
3. Количественная оценка концентрации LUV
- Оценивайте концентрацию LUV с помощью набора для количественного определения фосфолипидов, который позволяет оценить концентрацию холина. Этот анализ может быть применен при значительном количестве фосфолипидов с холином, содержащим полярную головку (>50% LUV).
- Приготовьте цветной реагент, растворив 18 мг хромогенной подложки в 3 мл прилагаемого буфера.
- Загрузите в полистирольную кювету размером 10 x 10 x 45 мм 3 мл цветного реагента.
- Используйте реагент чистого цвета в качестве холостого состояния (Blank). Добавьте 20 μL образца LUV (Test) или 20 μL стандартного раствора с известной концентрацией холина (Standard).
- Хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 5 минут при температуре 37 °C во всех условиях (пустой, тестовый и стандартный).
- Измерьте с помощью спектрофотометра поглощающую способность (оптическую плотность, OD) испытуемого образца и стандартного раствора с холостым раствором в качестве контроля на длине волны 600 нм.
- Проверьте значения OD, которые позволяют оценить концентрацию липидов LUV, C[LUV], в холиновом эквиваленте по сравнению со стандартом известной концентрации.
- Выполните расчет с использованием следующего уравнения:
C[LUV] (моль / л) = (образец наружного диаметра / стандарт наружного диаметра) x C[стандарт] (моль / л)
ПРИМЕЧАНИЕ: Набор для количественного определения фосфолипидов содержал стандартный раствор хлорида холина (139,6 мг/л) в концентрации 54 мг/дл, что соответствует молярной концентрации C[Standard] = 3,87 ммоль/л. OD Sample и OD Standard представляют собой поглощения, измеренные при 600 нм для растворов LUV и Choline, соответственно.
4. Определение размера и однородности LUV
- Выполните измерение с помощью прибора DLS для определения размера LUV (в нм) и индекса полидисперсии (PdI).
- Запрограммируйте соответствующую «стандартную операционную процедуру» (СОП), указав вязкость растворителя/буфера и используемой кюветы.
- Поместите 500 мкл раствора LUV в полумикрокювету из полистирола.
- Вставьте полумикрокювету из полистирола в инструмент DLS.
- При комнатной температуре измерьте распределение по размерам с точки зрения среднего размера (Z-среднее) распределения частиц и однородности (индекс полидисперсности, PdI).
- Все результаты получены в результате двух независимых измерений, выполненных каждое из трех повторяющихся циклов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартными значениями для LUV будет средний размер 137 ± 7 нм с PdI 0,149 ± 0,041.
5. Приготовление пептидных растворов
- Приготовьте стоковый раствор пептида, который следует проанализировать для проведения анализа на утечку.
- Растворите пептидный порошок (чистотой >95%) в чистой воде (например, 1 мг пептида в 500 мкл чистой воды).
заметка: Рекомендуется разводить пептиды в чистой воде и избегать солюбилизации диметилсульфоксида (ДМСО), которая может вызвать артефакты (например, мембранную пермеабилизацию).
- Вортексируйте пептидный раствор в течение 5 с.
- Ультразвуком нанесите раствор пептида в водяной ультразвуковой ванне в течение 5 минут, а затем центрифугируйте в течение 5 минут при давлении 12,225 x g. Соберите надосадочную жидкость для определения концентрации.
- Измерьте поглощение при длине волны 280 нм трех независимых пептидных разведений, а затем рассчитайте концентрацию пептида, используя его молярный коэффициент экстинкции ε (в зависимости от содержания триптофана и тирозина в пептидной последовательности) и правило Бера-Ламберта.
заметка: Если пептид содержит триптофан и тирозин, то молярный коэффициент экстинкции ε рассчитывается на основе триптофана ε = 5 690 М-1 см-1 и тирозина ε = 1 280 М-1 см-1. Если пептидная последовательность не содержит триптофана или тирозина, для измерения концентрации можно провести другой колориметрический анализ (например, BCA или Bradford).
- Раствор пептида развести в чистой воде до конечного раствора 100 мкМ и хранить при температуре 4 °С.<бр/>
заметка: В чистой воде не происходит деградации пептидов при хранении при температуре 4 °C. Тем не менее, концентрацию пептидов следует измерять каждые 2 недели, чтобы гарантировать, что не происходит испарения воды.
6. Анализ утечки флуоресценции
- Анализ утечки флуоресценции измеряется на спектрофлуориметре при комнатной температуре. Длина волны возбуждения и излучения фиксирована на Ex = 360 нм ± 3 нм и Em = 530 нм ± 5 нм соответственно.
- Разведите LUV в 1 мл буфера HEPES 2 до конечной концентрации 100 мкМ в кварцевой флуоресцентной кювете. Добавьте магнитную мешалку для гомогенизации раствора во время эксперимента.
- Измерьте только LUV в течение первых 100 с, между t = 0 с и t = 99 с, чтобы получить доступ к фоновой флуоресценции.
заметка: В течение всего эксперимента (15 минут) можно было также измерять только LUV, чтобы получить доступ к фоновой флуоресценции и потенциальным утечкам.
- После этого измеряют утечку как увеличение интенсивности флуоресценции при добавлении аликвот пептидного раствора в течение следующих 900 с (15 мин). Данный протокол проводится для каждой испытуемой концентрации пептида от 0,1 мкМ до 2,5 мкМ.
- Наконец, 100% флуоресценция была достигнута путем солюбилизации LUV добавлением 1 мкл Triton X-100 (0,1%, v/v), в результате чего зонд был полностью негасимым в диапазоне от t = 1000 с до t = 1100 с.
7. Количественная оценка утечки
- Подавите значения, полученные после t = 1,090 с, чтобы сохранить одинаковое количество баллов для каждого тестируемого условия.
- Рассчитайте минимальную флуоресценцию, Fmin, сделав среднее значение 50 точек между t = 0 с и t = 49 с (только LUV).
- Вычислите максимальную флуоресценцию, Fmax, сделав среднее значение 50 точек между t = 1,041 с и t = 1,090 с (LUV с Triton X-100).
- Рассчитайте процент утечки (%Leak) в каждой временной точке (t = x) в соответствии со следующим уравнением:
%Утечка(t=x) = (F(t=x) - Fмин) / (Fmax - Fмин) x 100
- Рассчитайте среднее значение и стандартное отклонение для значений, полученных при различном приготовлении LUV (n ≥ 2) для одного и того же условия.
- Отобразите процент утечки, %Leak(t=x), в зависимости от времени (s).
