1. Сбор и переработка растений
- Сбор и обработка образцов растений
- После сбора образцов растений проведите мгновенную заморозку, погрузив растительный материал в жидкий азот с помощью щипцов, и храните при температуре -80 °C. Если собранные образцы растений слишком велики для мгновенной заморозки, быстро охладите образцы с помощью сухого льда и как можно скорее перенесите в морозильную камеру при температуре -80 °C. Содержание макроэлементов в растительном материале может измениться после отделения тканей от растения, поэтому важно заморозить образцы растений как можно скорее после сбора.
ВНИМАНИЕ: Жидкий азот может вызвать сильное обморожение при контакте с кожей. Пожалуйста, убедитесь, что жидкий азот перевозится в утвержденных контейнерах и надевайте надлежащие СИЗ во время его работы, включая криоперчатки, очки для глаз, лицевой щиток, фартук и лабораторный халат.
- Лиофилизируйте растительный материал с помощью сублимационной сушилки, чтобы убедиться, что ткани метаболически неактивны во время удаления воды. Сушите до тех пор, пока масса образца не стабилизируется, чтобы убедиться, что вся вода была удалена.
- Как только образцы высохнут, измельчите в мелкий порошок с помощью кофемолки или мельницы. Храните образцы в шкафу для сушки до проведения анализа.
2. Анализ растворимых белков
- Подготовка образцов
- Взвесьте повторяющиеся образцы каждой ткани, примерно по 20 мг каждый, в полистирольные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и пробирки-этикетки. Эти образцы впоследствии будут называться неизвестными образцами. Запишите точную массу каждого образца, так как эта информация потребуется для расчета % растворимого белка в каждом неизвестном образце. Используйте микроцентрифужные пробирки с запирающимися крышками, так как неблокируемые крышки могут открыться во время последующей стадии нагрева, что приведет к потере раствора образца.
- Солюбилизируйте и изолируйте неизвестные образцы белков
- С помощью микропипеттора добавьте в каждую пробирку 500 мкл 0,1 М NaOH. Плотно закройте крышки и обрабатывайте ультразвуком в течение 30 минут. Разогрейте водяную баню до 90 °C.
ВНИМАНИЕ: Гидроксид натрия является прочным основанием и может вызвать ожоги при контакте с кожей. Несмотря на то, что 0,1 М NaOH представляет собой низкую концентрацию, надевайте защитные перчатки, чтобы избежать раздражения кожи.
- Поместите трубки в решетку в водяную баню на 15 минут.
- Центрифужные пробирки при плотности 15 000 x g в течение 10 минут. Пипетируйте надосадочную жидкость в новые маркированные микроцентрифужные пробирки, используя новый наконечник для дозатора для каждого образца. Добавьте 300 мкл 0,1 М NaOH в пробирку, содержащую гранулу, и снова центрифугируйте при 15 000 x g в течение 10 минут. Снова соберите надосадочную жидкость и соедините ее с другой жидкостью надосадочной жидкости из того же образца. Это потенциальная точка остановки, и при необходимости образцы могут храниться при температуре 4 °C в течение ночи.
- Осаждение растительных белков
- Нейтрализуйте pH надосадочной жидкости, добавив 11 μL 5,8 M HCl. Подтвердите pH ~7, обмакнув лакмусовую бумагу в каждый раствор образца.
ВНИМАНИЕ: Соляная кислота является сильной коррозионной кислотой, которая может вызвать ожоги при контакте с кожей (нанесение на кожу или ингаляция). Пожалуйста, надевайте перчатки, чтобы предотвратить раздражение кожи при работе с HCl.
- Добавьте 90 мкл 100% трихлоруксусной кислоты (ТСА) в каждую пробирку и инкубируйте пробирки на льду в течение 30 минут. Осаждение белков превратит раствор из прозрачного в непрозрачный. Если через 30 минут этого не произошло, поставьте пробирки в холодильник на 1 час. Это потенциальная точка остановки, и при необходимости образцы могут храниться при температуре 4 °C в течение ночи.
ВНИМАНИЕ: Трихлоруксусная кислота вызывает коррозию. Пожалуйста, надевайте перчатки при обращении, чтобы предотвратить контакт с кожей и избежать вдыхания.
- Центрифугируйте образцы при давлении 13 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость TCA, отсасывая ее с помощью вакуумной линии, прикрепленной к тонкому стеклянному наконечнику для микропипетки (один и тот же наконечник можно использовать для всех образцов). Не тревожьте протеиновую гранулу, избегая сильного всасывания и сохраняя соответствующее расстояние между наконечником пипетки и гранулой.
- Быстро промойте гранулы 100 μл ацетона -20 °C. На этом этапе из гранулы удаляются остатки ТСА, которые могут помешать последующему анализу по Брэдфорду; Тем не менее, ацетон начнет растворять белковую гранулу, если оставаться в контакте слишком долго, поэтому ацетон следует добавить и быстро извлечь из гранулы в течение 5 секунд.
- Дайте ацетону испариться, поместив пробирки в вытяжной шкаф или холодильник. Затем растворите белковую гранулу, добавив 1 мл 0,1 М NaOH в каждую пробирку. Для полного растворения гранул может потребоваться несколько циклов нагрева в водяной бане, вортексирования и ультразвука.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чем дольше трубки находятся в вытяжном шкафу или холодильнике и чем суше становятся гранулы, тем сложнее будет их повторно растворить. Рекомендуется высушить гранулу в течение 30 минут, а затем проверять наличие ацетона каждые 10-15 минут, пока не станет ясно, что ацетон испарился (пары ацетона не обнаруживаются).
- Смешайте стандартные растворы, разбавьте растворы неизвестных образцов и количественно оцените общее содержание белка в неизвестных образцах с помощью анализа Брэдфорда.
- Приготовьте стандартные растворы бычьего иммуноглобулина G (IgG) в соответствии с концентрациями, указанными в таблице 1 (лиофилизированный или стоковый раствор IgG можно смешивать с деионизированной водой для достижения каждой концентрации). Нормы хранить при температуре 4 °C. В 96-луночный планшет добавьте по 160 мкл каждого стандартного раствора IgG в трех экземплярах, начиная с положения А1 луночного планшета (0 мкг/мкл в положении А1, А2, А3, 0,0125 мкг/мкл в положениях В1, В2, В3 и т. д.).
- Приготовьте разбавленный раствор NaOH, добавив 50 мкл 0,1 М NaOH к 950 мкл дистиллированной воды. В качестве пустого отрицательного контроля добавьте 60 мкл этого раствора в луночный планшет в трех экземплярах (позиции G1, G2, G3).
- Приготовьте разведения неизвестных образцов, добавив 50 мкл каждого раствора образца к 950 мкл дистиллированной воды в новой микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Затем добавьте по 60 мкл каждого разбавленного образца в луночный планшет в трех экземплярах, начиная с положения H1. Планшет на 96 лунок должен позволять анализировать 6 эталонов, 1 пустой и 25 неизвестных образцов при чтении в трех экземплярах. Каждая анализируемая лунка должна содержать свои стандартные и холостые образцы IgG.
- Добавьте 100 мкл дистиллированной воды во все пустые и неизвестные лунки для проб. Теперь каждая лунка должна содержать в общей сложности 160 μл. Используя многоканальную пипетку (8 каналов), добавьте 40 μL белкового красителя Coomassie brilliant blue G-250 в каждую лунку в первой колонке луночного планшета. Смешайте краситель с образцами, погрузив в воду несколько раз. Повторите то же самое для всех остальных колонок, заменив наконечники пипеток во избежание загрязнения.
ВНИМАНИЕ: Кумасси ярко-голубой G-250 является раздражителем, и следует избегать контакта с кожей, глазами или легкими. Пожалуйста, надевайте перчатки, чтобы предотвратить контакт с кожей. При попадании на кожу это изделие испачкается.
- Используйте иглу, чтобы лопнуть любые пузырьки, присутствующие в лунках, так как они могут повлиять на показания микропланшетного спектрофотометра. Очистите иглу, чтобы избежать загрязнения между лунками. Дайте микропланшету поинкубироваться при комнатной температуре в течение 5 минут.
- С помощью микропланшетного спектрофотометра зарегистрируйте значения поглощения для каждой лунки на длине волны 595 нм.
Таблица 1. Расчет стандартной кривой для анализа растворимых белков.Количество белка в каждом стандарте рассчитывается путем умножения концентрации каждого стандарта на количество стандартного раствора в каждой лунке (160 мкл).
| Концентрация IgG (мкг/мкл) | Белок в стандартных образцах (μг) |
| 0,0000 | 0 |
| 0.0125 | 2 |
| 0.0250 | 4 |
| 0,0375 | 6 |
| 0.0500 | 8 |
| 0.1000 | 16 |
