$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Сбор и переработка растений
- После сбора образцов растений проведите мгновенную заморозку, погрузив растительный материал в жидкий азот с помощью щипцов, и храните при температуре -80 °C. Если собранные образцы растений слишком велики для мгновенной заморозки, быстро охладите образцы с помощью сухого льда и как можно скорее перенесите в морозильную камеру при температуре -80 °C. Содержание макроэлементов в растительном материале может измениться после отделения тканей от растения, поэтому важно заморозить образцы растений как можно скорее после сбора.
осторожность: Жидкий азот может вызвать сильное обморожение при контакте с кожей. Пожалуйста, убедитесь, что жидкий азот перевозится в утвержденных контейнерах и надевайте надлежащие СИЗ во время его работы, включая криоперчатки, очки для глаз, лицевой щиток, фартук и лабораторный халат.
- Лиофилизируйте растительный материал с помощью сублимационной сушилки, чтобы убедиться, что ткани метаболически неактивны во время удаления воды. Сушите до тех пор, пока масса образца не стабилизируется, чтобы убедиться, что вся вода была удалена.
- Как только образцы высохнут, измельчите в мелкий порошок с помощью кофемолки или мельницы. Храните образцы в шкафу для сушки до проведения анализа.
2. Анализ легкоусвояемых углеводов
- Подготовка образцов
- Взвесьте повторяющиеся образцы каждой ткани, примерно по 20 мг каждая, в стеклянные пробирки объемом 15 мл с резиновыми завинчивающимися крышками (длина 100 мм). Эти образцы впоследствии будут называться неизвестными образцами. Пробирки маркируют водостойким маркером или маркировочной лентой на крышках и записывают точную массу каждого образца, так как эта информация потребуется для расчета % углеводов в каждом неизвестном образце.
- Извлекайте легкоусвояемые углеводы из каждого неизвестного образца.
- Добавьте 1 мл 0,1 M H2SO4 в каждую пробирку и плотно закрутите крышки на пробирки. Поставить на кипящую водяную баню на 1 час.<бр/>
осторожность: Серная кислота очень агрессивна. Пожалуйста, наденьте перчатки, очки для глаз и фартук при работе с H2SO4 и выполняйте этот шаг в вытяжном шкафу.
- Охладите трубки на теплой водяной бане. Разлейте содержимое пробирок в промаркированные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (не беспокойтесь, если в стеклянных пробирках останется немного растительного материала).
- Центрифужные пробирки при плотности 15 000 x g в течение 10 минут. Удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки и поместите в новые пробирки для микроцентрифуг объемом 1,5 мл с маркировкой. На этом этапе трубки можно охладить на ночь. Если вы продолжаете анализ, обратитесь к шагу 2.3.2.
- Смешайте стандартные растворы и количественно оцените общее содержание легкоусвояемых углеводов в неизвестных образцах.
- Приготовьте стандартные растворы D(+) глюкозы в концентрациях, указанных в таблице 1. Приготовьте шесть стеклянных пробирок по 400 мкл каждого стандартного раствора.
- Нанесите 15 μL каждого неизвестного образца в отдельную пробирку и добавьте 385 μL дистиллированной воды в каждую пробирку, чтобы получить общий объем 400 μL в каждой пробирке. В вытяжной шкаф добавьте 400 μл 5% фенола в каждую стандартную и неизвестную пробу пробирки, а затем быстро нанесите пипеткой 2 мл концентрированного H2SO4 в каждую пробирку. Не прикасайтесь к содержимому пробирки наконечником пипетки, просто добавьте его на поверхность раствора (лучше всего для этого подходит пипетка-репетир).
- Дайте пробиркам поинкубироваться в течение 10 минут, а затем тщательно перемешайте содержимое пробирок. Инкубировать еще 30 минут.
осторожность: Фенол и серная кислота являются коррозионными раздражителями. Чтобы защититься от воздействия на кожу, глаза и вдыхания, этот шаг следует выполнять в вытяжном шкафу с использованием соответствующих СИЗ, которые включают в себя: лицевой щиток или очки для глаз, резиновые перчатки, лабораторный фартук и ботинки. Смешивание фенола с серной кислотой также приводит к экзотермической реакции, в результате которой пробирки становятся горячими.
- Пипетка 800 мкл образца из каждой пробирки в каждую из 3 полистирольных полумикрокювет объемом 1,5 мл (3 технических повторения на образец). Установите спектрофотометр на 490 нм. Выполните калибровку на чистой кювете, содержащей дистиллированную воду, перед считыванием стандартов или неизвестных образцов, а также периодически на протяжении всех измерений образцов. Пропустите каждую кювету через спектрофотометр и запишите поглощение. Усреднение по техническим репликациям для каждой неизвестной выборки.
заметка: В некоторых случаях образцы могут превысить верхний порог поглощения. Если это так, то образцы следует разбавлять на этапе 1.3.1. Разведения также должны учитываться при последующих расчетах.
- Рассчитайте среднее поглощение для каждого стандарта.
заметка: Чтобы рассчитать общее количество легкоусвояемых углеводов, присутствующих в каждом неизвестном образце с помощью стандартной кривой, проще всего регрессировать среднее поглощение каждого стандарта относительно микрограммов D(+)глюкозы, присутствующих в каждом стандарте, но также можно построить график концентрации D(+)глюкозы (μг/мкл) каждого стандарта, если это необходимо. Однако следующие расчеты относятся к стандартной кривой, основанной на микрограммах, а не на концентрациях (μг/μл).
- Рассчитайте стандартную кривую, построив график средней абсорбции в зависимости от общего количества D(+)глюкозы (μг) в каждом стандартном растворе. Подгоните линию линейной регрессии к этим данным, а затем используйте следующее уравнение для вычисления общего количества углеводов (μг) в каждой неизвестной выборке:
Mc = (((Ax – b)/m)/(15))*1000
Mc = μг углеводов в образце
Ax = средняя поглощающая способность неизвестного образца
b = y-точка (стандартная линия регрессии)
m = уклон (стандартная линия регрессии)
Коэффициент корреляции этой линии должен быть больше 0,98 и обычно около 0,99. Затем используйте следующее уравнение, чтобы определить процентное содержание углеводов в каждом образце:
Pc = ((Mc/1000)/(Mi))*100
Pc =% углеводов
Mi = начальная масса образца (мг)
Таблица 1. Расчет стандартной кривой для анализа легкоусвояемых углеводов. Количество глюкозы в каждом стандарте рассчитывается путем умножения концентрации каждого стандарта на количество стандартного раствора в каждой пробирке (400 мкл)
| Концентрация D(+)глюкозы (мкг/мкл) | D(+)глюкоза в стандартных образцах (мкг) |
| 0,0000 | 0 |
| 0,0375 | 15 |
| 0.0750 | 30 |
| 0,1125 | 45 |
| 0,1500 | 60 |
| 0,1875 | 75 |