Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Анализ роста токсоплазмы на основе люциферазы
- Засейте фибробласты крайней плоти человека (HFF) за 1 неделю до инокуляции паразита, чтобы убедиться, что клетки хозяина полностью сливаются. Проведите имитационный анализ в прозрачной пластине, чтобы убедиться, что паразиты остаются внутриклеточными в течение всего периода оценки.
заметка: Здесь анализ проводится в 96-луночных микропланшетах. В зависимости от экспериментальных потребностей, он может быть масштабирован до 384 или 1536-луночных микропланшетов.
- Пропустите паразитов токсоплазмы в конфлюентные HFF за 2 дня до использования, переложив ~0,3-0,4 мл полностью лизированных паразитов в колбу T25. Инкубируйте инфицированные клетки-хозяева при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 дней.
- Проведите 5 мл свежлизированных паразитов через безопасную иглу 21 G 5 раз, чтобы освободить внутриклеточных паразитов, затем пропустите через фильтр 3 мкм для удаления остатков клеток хозяина. Промойте остатки паразитов из колбы, используя 7 мл феноловой среды D10, не содержащей фенола, красного, затем снова пропустите через фильтр.
- Центрифугируйте паразитов при 1000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре (ОТ). Слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл среды, не содержащей фенола красных D10.
- Подсчитайте паразитов с помощью гемоцитометра для определения концентрации.
- Разбавьте паразитов до 1 x 104 паразитов/мл для штамма дикого типа (WT). Для штаммов паразитов с недостаточным ростом, соответственно увеличьте концентрацию, чтобы наблюдать значительное увеличение сигналов люциферазы.
- Тщательно отсаживайте среду из 96 луночных микропланшетов, предварительно засеянных HFF, и инокулируйте 150 мкл ресуспензии паразита в лунки в формате трех столбцов и пяти рядов, что представляет собой три технические репликации и пять временных точек.
- Инкубируйте микропланшет при 37 °C и 5%CO2 в течение 4 ч.
- Осторожно отсасывайте среду из лунок, чтобы удалить неинвазированных паразитов, затем заполните лунки феноловыми безкрасными средами в каждом ряду (кроме первого ряда).
- Смешайте равные объемы PBS и 2x буфера для анализа люциферазы и разбавьте субстрат люциферазы до 12,5 мкМ.
- Добавьте по 100 мкл разведенного субстрата люциферазы в каждую лунку верхнего ряда. Инкубируйте микропланшеты при РТ в течение 10 минут, чтобы клетки полностью лизировались.
- Измерьте активность люциферазы с помощью считывателя микропланшетов. Настройки считывателя пластин приведены в таблице 1. Каждое показание представляет собой начальное количество инвазированных паразитов через 4 ч после заражения.
- Повторяйте шаги 1.9-1.12 для каждого ряда каждые 24 ч в течение 4 дней, не меняя среду. Эти показания отражают общее количество реплицированных паразитов через 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч после заражения.
- Рассчитайте средние показания в каждой временной точке и разделите их на средние показания за 4 часа, чтобы определить кратные изменения в росте паразитов с течением времени.
- Построение графиков данных с помощью программного обеспечения для построения графиков.
- Чтобы рассчитать время удвоения, построите график значений log2 изменений сворачивания в отдельных временных точках в течение времени инкубации. Используйте функцию линейной регрессии для вычисления наклона, который представляет время удвоения каждой деформации.
Таблица 1: Настройки считывателя микропланшетов для измерения активности люциферазы во время анализа роста токсоплазмы на основе люциферазы
| Люцифераза: | конечная точка |
| Время интеграции: | 1 с |
| Набор фильтров - Излучение: | Полный свет |
| оптика: | Вверх |
| прибыль: | 135 |
| Скорость чтения: | нормальный |
| задержка: | 100 мс |
| Высота считывания: | 4,5 мм |
