Экстракционный анализ Msp1 для изучения удаления неправильно локализованных белков TA

Аннотация

Источник: Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Восстановление экстракционной активности Msp1 с полностью очищенными компонентами. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует протокол in vitro для изучения Msp1-опосредованного удаления неправильно локализованных белков TA, интегрированных в липидный бислой липосом. Белки Msp1 и TA совместно восстанавливаются в липосомы, а АТФ-зависимая транслокация белков TA подтверждается путем аффинной очистки.

Протокол

1. Подготовка липосом

1. Комбинируйте запасы хлороформа липидов в соответствующих соотношениях, чтобы имитировать внешнюю митохондриальную мембрану.
   1. Приготовьте 25 мг липидной смеси. Мы используем ранее созданную смесь липидов, имитирующих митохондриальные мембраны, состоящую из молярного соотношения 48:28:10:10:4 фосфатидилхолина куриного яйца (ПК), фосфатидилэтаноламна куриного яйца (ПЭ), фосфатидилинозитола бычьей печени (ПИ), синтетического 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серина (DOPS) и синтетического 1',3'-бис[1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо]-глицерина (TOCL). Примеры расчетов приведены в таблице 1.
   2. Перед открытием доведите все запасы липидов до комнатной температуры, так как это ограничит конденсацию. Поскольку большинство лабораторий не имеют точного способа измерения концентрации липидов, любая вода, поглощенная хлороформом, изменит концентрацию липидного запаса и, следовательно, соотношение липидов, используемых в анализе.
   3. Так как липидные запасы идут в стеклянных ампулах, переложите необходимое количество липидов в стеклянный флакон с помощью шприца объемом 1 мл. Добавьте во флакон 2 мг дитиотреитола (DTT) для предотвращения окисления липидов. Работайте быстро, так как испарение хлороформа изменит концентрацию липида.
   4. Переложите остатки липидов в отдельный стеклянный флакон и установите на него перегородки PFTE. Добавьте 2 мг DTT во флакон, оберните парапленкой и храните при температуре -20 °C, чтобы предотвратить окисление липидов. Старайтесь использовать липиды в течение 3 месяцев после переноса во флаконы. Чтобы предотвратить потенциальное загрязнение запасов хлороформа стоком маркеров, переносите наклейки с оригинальных ампул на стеклянные флаконы, а не маркируйте маркером.
2. Испаряйте хлороформ под очень щадящей струей азота, одновременно вращая стеклянный флакон непрерывно вручную в вытяжном шкафу, по сути действуя как ручной ротапов. Вращайте флакон с постоянной скоростью (20-40 об/мин) вручную, чтобы липиды продолжали двигаться. Цель состоит в том, чтобы испарить весь хлороформ и получить равномерное покрытие липидами по всему стеклянному флакону.
   осторожность: Хлороформ нейротоксичен, и этот этап следует выполнять в вытяжном шкафу.
   1. Подложите свежую пастеровскую пипетку к азотной трубке. Не позволяйте липидам выплескиваться из флакона или на пипетку Пастера. Направьте наконечник на дно флакона, чтобы воздух отскакивал от дна и выталкивал липиды вверх к центру флакона. Равномерное покрытие по всему флакону должно быть равномерным, при этом не допуская скопления в углах или на крышке. Весь этот процесс занимает около 5 минут.
   2. По мере того, как смесь загустевает в «бусину» липидов, направляйте ее в центр флакона, изменяя угол наклона флакона. Как только шарик начнет уменьшаться, немного увеличьте поток азота, чтобы рассеять шарик, следя за тем, чтобы липиды не выдувались из флакона.
3. Удалите остатки хлороформа под вакуумом.
   1. Поместите стеклянный флакон на домашний вакуумный или мембранный вакуумный насос на 1 час, чтобы удалить большую часть остатков хлороформа. Эти пылесосы, как правило, недостаточно сильны, чтобы удалить весь хлороформ, но они могут лучше переносить небольшое количество растворителя, чем ротационные вакуумы.
   2. Поставьте флакон на сильный вакуум (<1 мТорр) на 12-16 ч, чтобы удалить все остатки хлороформа. Следите за тем, чтобы во время этого процесса не ударяться о флакон.
4. Ресуспендируют липиды в 1,25 мл липосомального буфера (50 мМ HEPES Koh pH 7,5, 15% глицерина, 1 мМ DTT). Поскольку мы начали с 25 мг липидов, это привело к концентрации 20 мг/мл. Полностью суспендируйте липиды без видимых кусочков. Если липиды скапливаются в углу флакона, это может быть длительным процессом.
   Энергично перебейте
   1. флакон до тех пор, пока образец не станет молочно-однородным. Мы обнаружили, что если выпаривание хлороформа было проведено должным образом накануне вечером, этот процесс занимает около 5-10 минут.
   2. Чтобы обеспечить полную ресуспензию липидов, вращайте колесо при комнатной температуре в течение 3 часов при ~80 оборотах в минуту. Вынимайте флакон из колеса один раз в час на 1 минуту вортекса, чтобы обеспечить равномерное перемешивание.
5. Осторожно перенесите липиды в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Выполните 5 циклов замораживания-размораживания, используя жидкий азот для замораживания и нагревательный блок при температуре 30 °C для размораживания. Этот шаг помогает преобразовать многослойные везикулы в однопластинчатые везикулы.
6. Выдавите липиды.
   1. Во время циклов замораживания-размораживания подготовьте мини-экструдер. Собираем мини-экструдер с опорами фильтра 10 мм и поликарбонатной мембраной нужного размера пор (используем 200 нм). Размер фильтра будет влиять на размер липосомы, что повлияет на концентрацию белков, необходимых для восстановления (Шаг 2.3).
   2. Поместите мини-экструдер на горячую плиту и доведите температуру экструдера до 60 °C.
   3. Наберите липиды в газонепроницаемый стеклянный шприц объемом 1 мл и осторожно поместите в один конец мини-экструдера. Поместите пустой газонепроницаемый шприц на другую сторону мини-экструдера. Дайте липидам сбалансироваться до температуры экструдера в течение 5-10 минут.
   4. Перенесите липиды в альтернативный шприц, осторожно надавливая на поршень наполненного шприца. Протолкните раствор из альтернативного шприца в исходный шприц. Повторите этот процесс 15 раз, чтобы на^15-м проходе липиды закончились в альтернативном шприце. Следите за объемом в каждом проходе, чтобы убедиться в отсутствии утечек.
7. Приготовьте одноразовые аликвоты липидов, мгновенно заморозьте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C. Липосомы стабильны при температуре -80 °C в течение нескольких месяцев. Для восстановления требуется 10 мкл липосом за один раз (Шаг 2.3.4), поэтому удобно готовить 10 мкл или 20 мкл аликвот.

2. Восстановление Msp1 и модельного белка TA

1. Приготовьте восстанавливающий буфер: 50 мМ HEPES pH 7,5, 200 мМ ацетата калия, 7 мМ ацетата магния, 2 мМ DTT, 10% сахарозы, 0,01% азида натрия, 0,2-0,8% Deoxy Big Chaps (DBC).
   1. Оптимизируйте условия восстановления для новой партии липосом. Концентрация DBC и биогранул, необходимая для оптимального восстановления, варьируется в зависимости от используемой партии липосом. Чтобы ограничить вариативность от подготовки к препу, используйте одну и ту же партию DBC для всех экспериментов. При изменении лотов DBC повторите процесс оптимизации.
   2. Настройте серию восстановительных препаратов с различными концентрациями ДБК (0,2% - 0,8%) и биогранул (25 мг - 100 мг) каждый раз при приготовлении новой партии липосом. Важно не опускать DBC ниже критической концентрации мицелл (CMC) ~0,12%. После того, как условия оптимизированы, мы рекомендуем собрать все данные с использованием тех же условий подготовки и восстановления липосом.
   3. Анализ эффективности различных условий восстановления с использованием экстракционного анализа, описанного на этапе 3.
2. Приготовьте биогранулы в конечной концентрации 250 мг/мл.
   1. Взвесьте 2,7 г высушенных биогранул и повторно суспендируйте в центрифужной пробирке объемом 50 мл 100% метанола (около 45 мл) для смачивания шариков. Первоначально смочите биогранулы в метаноле, чтобы предотвратить попадание воздуха в поры гранул. После добавления метанола держите биогранулы влажными, так как любой воздух, захваченный биогранулами, изменит их способность поглощать моющее средство.
   2. Удалите метанол путем 8-кратной промывки шариков примерно 45 мл сверхчистой воды (18,2 мОм), далее именуемой ddH₂O. Гранулы гранул путем отжима при 3 200 x г в течение 1 минуты. Сцедите жидкость и снова суспендируйте в ddH₂O.
   3. После промывки повторно суспендировать в 10 мл ddH₂O с 0,02% азидом натрия и хранить при 4 °C. Биогранулы можно хранить при 4 °C в течение нескольких месяцев. Этот запас составляет 250 мг/мл, так как предполагается, что ~0,2 г теряется во время промывки.
3. Рассчитайте размер липосомы и желаемое количество молекул белка TA и Msp1 на липосому. Это позволит определить концентрацию белка Msp1 и TA, необходимую для восстановления.
   1. Сначала рассчитаем количество молекул липидов в одной униламеллярной липосоме (_всего N) с помощью уравнения
      
      где d — диаметр липосомы, h — толщина бислоя, а a — площадь липидной головной группы.
      1. Измерьте диаметр липосомы с помощью DLS. В нашем примере было получено значение 70 нм для диаметра липосомы (d).
      2. Используйте значение 5 нм для h и 0,71^нм2 для a, что является размером головной группы для фосфатидилхолина. В данной конкретной ситуации _{общее количество} N составляет 37 610.
   2. Далее рассчитайте молярную концентрацию липида М_Липид, используя среднюю молекулярную массу липидов в смеси. В этом примере концентрация липидов составляет 20 мг/мл (Шаг 1.4), а средняя молекулярная масса липидов составляет 810 г/моль (Таблица 1). В результате получается значение 0,0247 М для _липида М.
   3. Далее рассчитайте молярную концентрацию липосом, М_{липосомы}, используя уравнение
      
      где M_Lipid – молярная концентрация липидов из Шага 2.3.2, а N_total – общее количество липидов на липосому, рассчитанное в Шаге 2.3.1. В этом примере исходная концентрация липосом 20 мг/мл составляет приблизительно 660 нМ.
   4. Рассчитайте количество белка Msp1 и TA, необходимое для реакции восстановления объемом 100 мкл.
      заметка: Конечная концентрация липидов в восстановительном аппарате составляет 2 мг/мл, что в 10 раз превышает запас липосом. Это дает конечную концентрацию липосом, равную 66 нМ. Конечная концентрация Msp1 составляет 792 нМ, что дает в среднем 12 копий (2 функциональных гексамера) на липосому. Конечная концентрация белка ТА составляет 660 нМ, что дает в среднем 10 копий на липосому.
4. В пробирке для ПЦР смешайте очищенный Msp1, белок TA и липосомы в буфере для восстановления. Порядок добавления следующий: буфер, белки и липосомы последние. Общий объем составляет 100 μл. Дайте смеси постоять на льду в течение 10 минут. Очистите белок Msp1 и TA.
   1. Используйте хорошо охарактеризованный модельный белок TA His-Flag-Sumo-Sec22 в качестве положительного контрольного субстрата при первом построении анализа. Эта конструкция имеет метку His-tag для легкой очистки, метку 3x-Flag для обнаружения по вестерн-блоттингу, домен Sumo для повышения растворимости и TMD белка ER-TA Sec22 для восстановления и распознавания с помощью Msp1.
   2. Убедитесь, что исходные растворы как Msp1, так и белка TA составляют приблизительно 100 мкМ, чтобы свести к минимуму влияние N-додецил β-D-мальтозида (DDM) от очистки белка на восстановление. Очищенный Msp1 содержится в 20 мМ HEPES pH 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 0,1 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорида (TCEP), 0,05% ДДМ, тогда как очищенный белок TA содержится в 50 мМ Tris pH 7,4, 150 мМ хлорида натрия, 10 мМ хлорида магния, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 10% глицерина, 0,1% ДДМ. Исходные растворы примерно 100 мкМ белка TA и мономера Msp1 гарантируют, что эти компоненты составят < 5% от конечного объема восстановления, что приводит к разбавлению DDM ниже CMC.
5. Добавьте нужное количество биошариков в пробу, чтобы удалить моющее средство.
   1. Отрежьте кончик наконечника для пипетки p200 примерно до 1/8 дюйма в диаметре, чтобы бусины могли пройти через наконечник. Тщательно прокрутите трубку с биошариками для получения однородной смеси и быстро снимите крышку и пипетку в объеме до того, как биошарики осядут. Переложите биошарики в пустую ПЦР-пробирку.
   2. Когда восстановление завершит свою 10-минутную инкубацию на льду, используйте неразрезанный наконечник пипетки, чтобы удалить всю жидкость из биогранул. Затем перелейте 100 мкл раствора в пробирку с биогранулами. Это нужно сделать быстро, чтобы биобусины не задерживали воздух, из-за чего бусины будут плавать.
6. Дайте восстановителю вращаться на колесе со скоростью ~80 об/мин в течение 16 часов при температуре 4 °C.
7. Удалите восстановленный материал из биогранул. Сделайте быстрый отжим в пикопуге, чтобы гранулировать биогранулы, а затем с помощью неразрезанного наконечника пипетки перенесите восстановленный материал в чистую ПЦР-пробирку. Повторяйте этот процесс 1-2 раза, пока в образце не останется биогранул. Храните восстановление на льду.
8. Предварительно очистите восстановленный материал, чтобы удалить любые белки, которые не смогли восстановиться в липосомах.
   1. Приготовьте экстракционный буфер: 50 мМ HEPES pH 7,5, 200 мМ ацетата калия, 7 мМ ацетата магния, 2 мМ DTT, 100 нМ хлорида кальция.
   2. Уравновесьте спиновые колонки глутатиона с помощью экстракционного буфера в соответствии с указаниями производителя. Обычно это включает в себя 3 цикла промывки с 400 мкл буфера, а затем центрифугирование при 700 x g в течение 2 минут при комнатной температуре для удаления буфера.
   3. Добавьте по 5 мкМ каждого шаперона (GST-SGTA и GST-Calmodulin) в восстановленный материал. Эти шапероны будут связываться с ВНЧС любых белков, которые не смогли восстановиться в липосомы. Очищение шаперонов было описано ранее.
      заметка: Эти сопровождающие коммерчески доступны, но мы предпочитаем проводить очистку внутри компании, чтобы контролировать стоимость и качество. Оба белка находятся в 20 мМ трис рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия и 0,1 мМ TCEP и имеют исходную концентрацию около 160 мкМ. SGTA распознает субстраты с высокогидрофобной TMD, в то время как кальмодулин связывает TMD с умеренной гидрофобностью. Вместе этот коктейль с сопровождением может распознавать широкий спектр субстратов.
   4. Добавьте 100 μL экстракционного буфера в восстановленный материал, доведя объем до 200 μL. Добавьте его в уравновешенные спиновые колонки глутатиона. Обратите внимание, что спиновые колонки с глутатионом обеспечивают максимальное извлечение образца при объеме предварительной очистки 200 – 400 μл.
   5. Закупорьте вращающиеся колонны и вращайте со скоростью ~80 об/мин при 4 °C в течение 30 минут, чтобы шапероны могли сцепиться со смолой.
   6. Вращайте колонны при температуре 700 x g в течение 2 минут при комнатной температуре. Проточный поток представляет собой предварительно очищенный материал, который обеднен агрегированными белками. Держите материал на льду и приступайте непосредственно к экстракционному анализу.

3. Экстракционный анализ

1. Подготовьте пробирки для анализа SDS PAGE. Каждая реакция будет иметь 4 пробирки: INPUT (I), FLOW THROUGH (FT), WASH (W) и ELUTE (E).
   1. Добавьте 45 мкл образца ddH₂O в пробирку INPUT, 40 мкл ddH₂O в пробирку FLOW THROUGH и 0 мкл в пробирки WASH и ELUTE.
      заметка: Наилучшее соотношение сигнал/шум в этом анализе достигается, когда образцы WASH и ELUTE концентрируются в 5 раз по сравнению с образцами INPUT и FLOW THROUGH. Из-за разведения во время анализа необходимо взять 5 мкл пробы для пробы INPUT, 10 мкл пробы для проточной пробы и 50 мкл пробы для проб WASH и ELUTE.
   2. Добавьте 16,6 мкл 4x буфера загрузки SDS PAGE в каждую пробирку. Общий объем каждого образца составляет 50 мкл до загрузочного буфера SDS PAGE. Итоговый объем составляет 66,6 мкл (50 мкл образца + 16,6 мкл 4x буфера загрузки SDS PAGE).
2. Соберите пробу экстракции.
   1. Приготовьте реакцию экстракции, содержащую 60 мкл предварительно очищенных протеолипосом, 5 мкМ GST-SGTA, 5 мкМ GST-кальмодулина и 2 мМ АТФ. Соедините все реагенты, кроме АТФ, который используется для инициации реакции. Доведите до конечного объема 200 μл с помощью экстракционного буфера.
      заметка: Поскольку для каждого экстракционного анализа используется 60 мкл образца, одна регенерация может быть использована для трех различных экстракционных анализов. Проведите положительный и отрицательный контроль (+ATP и -ATP) на материале из одного и того же восстановленного материала.
   2. Предварительно прогрейте экстракцию в термоблоке при температуре 30 °C в течение 2 минут.
3. Начните анализ экстракции, добавив АТФ до конечной концентрации 2 мМ, и запустите таймер.
   1. Дайте 5-секундный спин в пикофугле, чтобы смешать АТФ с реакцией. Инкубировать реакцию при 30 °C в течение 30 минут.
   2. Во время инкубации возьмите 5 μл реакции и добавьте в пробирку INPUT. Время для этого гибкое.
   3. В течение этого инкубационного периода уравновешивайте одну спиновую колонку глутатиона для каждого образца в экстракционном анализе.
4. Выполните вытягивание шаперонов вниз, чтобы изолировать извлеченный материал.
   1. После завершения 30-минутной инкубации добавьте в пробирку 200 мкл экстракционного буфера, чтобы довести общий объем до 400 мкл. Добавьте в уравновешенную смолу глутатиона и дайте связать на колесе при 4° C в течение 30 минут.
   2. Вращайте колонны при давлении 700 x g в течение 2 минут при комнатной температуре, чтобы собрать поток. Возьмите 10 μЛ для проточной трубки. Этот образец содержит субстраты, которые все еще интегрированы в липидный бислой.
   3. Дважды промойте смолу 400 μл экстракционного буфера, сбрасывая поток. На третьей промывке не пропустите поток и возьмите 50 μл для пробирки WASH.
   4. Приготовьте 5 мл элюирующего буфера, добавив восстановленный глутатион до конечной концентрации 5 мМ в экстракционный буфер. Каждый раз готовьте этот буфер свежим.
   5. Добавьте 200 μL элюирующего буфера в спиновую колонку. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут. Вращайте при 700 x g в течение 2 минут при комнатной температуре для разбавления. Не пропускайте поток. Повторите процесс еще раз так, чтобы общий объем элюирования составил 400 μл.
   6. Возьмите 50 мкл образца из образца Elution и добавьте его в пробирку ELUTE.

шт. См. См. См. Сталь См. См. См. См. См. мм См. г. Сталь См.

липид	Моль %	Мвт	Среднее МВт	мкм в 25 мг	мг в 25 мг	Запас хлора (мг/мл)	мкл для 25 мг
ПК	48%	770	369,6	14.82	11.41	25	456.4
ПЭ	28%	746	208.88	8.64	6.45	25	258,0
пи	10%	902	90,2	3.09	2.78	10	278,5
DOPS	10%	810	81	3.09	2.50	10	250,1
ТОКЛ	4%	1502	60.08	1.23	1.85	25	74,2
Conc. Corr Avg MW				809.76
μмоль в 25 мг				30.87

Таблица 1: Расчет образцов для получения липосом. Основными целями этой таблицы являются расчет скорректированной средней молекулярной массы концентрации липидной смеси и объема каждого липидного запаса, необходимого для создания липосом. MW и концентрация запасов указываются на этикетках продуктов. Липиды и мольные % выбираются пользователем.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Биошарики	Био-Рад	1523920
Фосфатидилинозитол печени крупного рогатого скота	Аванти	840042К	пи
Фосфатидилхолин куриного яйца	Аванти	840051С	ПК
Фосфатидилэтаноламин куриного яйца	Аванти	840021С	ПЭ
Опоры фильтров	Аванти	610014
Стеклянный флакон	ВВР	60910Л-1
Спиновая колонка с глутатионом	Термо Фишер	PI16103
Мини-экструдер	Аванти	610020
Синтетический 1, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин	Аванти	840035К	DOPS
Синтетический 1', 3'-бис[12-диолеол-снглицеро-3-фосфо]-глицерин	Аванти	710335С	ТОКЛ
Шприц 1 мл	Норма 53548-001
Шприц 1 мл газонепроницаемый	Avanti 610017