Экстракционный анализ Msp1 для изучения удаления неправильно локализованных белков TA

Аннотация

Источник: Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Восстановление экстракционной активности Msp1 с полностью очищенными компонентами. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует протокол in vitro для изучения Msp1-опосредованного удаления неправильно локализованных белков TA, интегрированных в липидный бислой липосом. Белки Msp1 и TA совместно восстанавливаются в липосомы, а АТФ-зависимая транслокация белков TA подтверждается путем аффинной очистки.

Протокол

1. Подготовка липосом

1. Комбинируйте запасы хлороформа липидов в соответствующих соотношениях, чтобы имитировать внешнюю митохондриальную мембрану.
   1. Приготовьте 25 мг липидной смеси. Мы используем ранее созданную смесь липидов, имитирующих митохондриальные мембраны, состоящую из молярного соотношения 48:28:10:10:4 фосфатидилхолина куриного яйца (ПК), фосфатидилэтаноламна куриного яйца (ПЭ), фосфатидилинозитола бычьей печени (ПИ), синтетического 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серина (DOPS) и синтетического 1',3'-бис[1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо]-глицерина (TOCL). Примеры расчетов приведены в таблице 1.
   2. Перед открыт....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Биошарики	Био-Рад	1523920
Фосфатидилинозитол печени крупного рогатого скота	Аванти	840042К	пи
Фосфатидилхолин куриного яйца	Аванти	840051С	ПК
Фосфатидилэтаноламин куриного яйца	Аванти	840021С	ПЭ
Опоры фильтров	Аванти	610014
Стеклянный флакон	ВВР	60910Л-1
Спиновая колонка с глутатионом	Термо Фишер	PI16103
Мини-экструдер	Аванти	610020
Синтетический 1, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-L-серин	Аванти	840035К	DOPS
Синтетический 1', 3'-бис[12-диолеол-снглицеро-3-фосфо]-глицерин	Аванти	710335С	ТОКЛ
Шприц 1 мл	Норма 53548-001
Шприц 1 мл газонепроницаемый	Avanti 610017