Анализ на β-галактозидазу для оценки лекарственно-индуцированной цитотоксичности у паразитов

Аннотация

Источник: Alonso, V. L. et al. In vitro Скрининг всех стадий жизненного цикла Trypanosoma cruzi с использованием паразитов, экспрессирующих β-галактозидазу. J. vis. Exp. (2021)

В этом видео мы описываем простой и надежный метод определения цитотоксического потенциала трипаноцидного препарата против паразита, Trypanosoma cruzi, экспрессирующего фермент β-галактозидазу. β-галактозидаза служит индикатором лизиса клеток, и ее активность может быть использована для оценки эффектов препарата.

Протокол

1. Анализ β-галактозидазы

ПРИМЕЧАНИЕ: Количественное определение активности β-галактозидазы используется как косвенный способ определения количества паразитов. Ожидается, что рост будет ингибироваться в присутствии трипаноцидного соединения, что приведет к меньшему количеству паразитов по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения, что отразится на более низкой активности β-галактозидазы и, следовательно, на более низкой абсорбции.

1. Инкубируйте паразитов с помощью BZN
   1. Добавьте 100 мкл соответствующего 2x раствора бензнидазола (BZN) на лунку для достижения конечной концентрации BZN 80, 40, 20, 10, 5 и 2,5 мкМ к 100 мкл суспензии эпимастиготы, клеток Vero с амастиготами (через 2 дня после заражения) или трипомастигот в 96-луночном планшете.
   2. Эпимастиготы инкубируют при 28 °C в течение 72 ч, а трипомастиготы или инфицированные клетки Vero с амастиготами в течение 24 ч при 37 °C и 5% CO₂.
      заметка: Концентрацию каждого препарата следует оценивать по крайней мере в трех экземплярах и включать контрольные культуры эпимастигот, трипомастигот и инфицированных диметилсульфоксидом (ДМСО) клеток Vero.
2. Колориметрическая реакция
   1. После инкубационного периода лечения, если инфицированные клетки Vero или трипомастиготы находятся в модифицированной среде Dulbecco Eagle Medium (DMEM) с феноловым красным, замените среду 100 мкл 1x PBS, чтобы избежать помех. Выполните тройную заготовку лунок, содержащих только 100 мкл соответствующей среды (или 1x PBS в зависимости от обстоятельств).
      заметка: Нет необходимости удалять питательную среду для эпимастигот в случае ЛИТ среды или DMEM без фенолового красного. ДМЭМ с феноловым красным еще можно использовать; Подготовьте заготовку только с помощью DMEM, чтобы измерить абсорбцию основания, а затем вычтите это значение во время анализа данных. Среда насекомых Шнайдера, которая является бесцветной, является альтернативой эпимастиготам.
   2. Добавьте 40 μL раствора субстрата хлорфенолового красного β-D-галактопиранозида (CPRG) и 10 μL раствора моющего средства в каждую лунку, получая конечную концентрацию 200 μM CPRG и 0,1% моющего средства в конечном объеме 250 μL в каждой лунке><. заметка: Раствор CPRG и моющее средство могут быть добавлены вместе в конечном объеме 50 μл на лунку.
   3. Инкубировать при 37 °C в течение 2 ч и измерить поглощение при длине волны 595 нм в микропланшетном спектрофотометре><. заметка: Ожидаемое изменение цвета от желтого до красновато-коричневого при ферментативном расщеплении β-галактозидазы (рисунок 1A). Время инкубации может быть увеличено до 4 часов, а спектры поглощения хлорфенолового красного могут считываться в диапазоне от 570 до 595 нм при аналогичной подгонке кривой. Инкубация продолжительностью до 24 ч в присутствии субстрата CPRG показала аналогичную кривую подгонки.

Результаты

Рисунок 1: Расчет значения IC50 бензнидазола для формы эпимастиготы Dm28c. (A) 96-луночный планшет с эпимастиготами, обработанными различными концентрациями BZN (2,5, 5, 10, 20, 40 и 80 мкМ) до добавления CPRG (1), после первоначального добавления CPRG и моющего средства (2) и после инкубации с CPRG и моющим средством, показывающим изменение цвета (3). (B) XY-график ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
96-луночные планшеты	Корнинг	No 3599
Бензнидазол	Сигма Олдрич	419656
5 мл серологической пипетки стерильной	Джет Биофил	GSP010005
10 мл серологической пипетки стерильной	Джет Биофил	GSP211010
Шкаф биобезопасности	Телстар	Био II А/
КПРГ	Рош	10 884308001	Хлорфенол красный-β-D-галактопиранозид
ДМЭМ, высокий уровень глюкозы	Thermo Fisher Cientific	12100046	порошок
Дмсо	Синторган	СИН-061	Диметилсульфоксид
Фетальная сыворотка для теленка	Интернегоциос С.А.	ФТС ФРА 500	Стерильные и термоинактивированные
Элементы Vero	АТКС	ЦРЛ-1587
Микропланшетный спектрофотометр	Биотек	Синергия HTX
Микроцентрифужная пробирка 1,5 мл	Тарсон	500010-Н
G418 раствор дисульфатной соли	Рош	Г418-РО	Исходная концентрация: 50 мг/мл