Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Высвобождение эндогенных моноаминов ex-vivo из мозговых срезов или проколов
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство, используемое для этого раздела, состоит из 48-луночного планшета и держателя для салфеток, изготовленных из шести микроцентрифужных фильтров без встроенных фильтров, подключенных к карбогенной линии (Рисунок 1). Для изготовления держателя используйте прочный пластиковый стержень (например, от скребка для ячеек) и приклейте к нему фильтрующие блоки микроцентрифуги без встроенных фильтров. Дайте ему высохнуть в течение 1-2 дней. Время, необходимое для эксперимента по высвобождению эндогенных моноаминов, и концентрации амфетамина, флуоксетина и кокаина основаны на современной литературе и предыдущих протоколах.
- Активация тканей
- Перенесите мозговую ткань в каждую лунку камеры оттока и дайте возможность восстановиться в течение 30-50 минут при 37 °C на предметном нагревателе в 0,5-1 мл кислородосодержащего буфера для оттока, с постоянным, мягким бурлением (рис. 1B1).
- Во время такой инкубации разведите препараты до нужной для эксперимента концентрации. Все препараты должны быть растворены в буфере для оттока, а концентрации основаны на современной литературе.
- Первая инкубация
- Переместите держатель для салфеток с тканью мозга в лунки, содержащие 500 мкл кислородосодержащего буфера для оттока, и инкубируйте в течение 20 минут при температуре 37 °C. Убедитесь, что буфер практически не транспортируется, постукивая по держателю по краю лунки до тех пор, пока в держателе не останется избыточного буфера.
- В экспериментах с фармакологическими агентами, такими как ингибиторы транспортера моноаминов, инкубируйте образцы тканей с препаратами, разведенными в кислородосодержащем буфере оттока (например, 10 мкМ флуоксетина, 40 мкМ кокаина; см. рис. 1B2). Итоговый объем в каждой лунке составит 500 μл.
- Вторая инкубация
- Переместите держатель с салфеткой в новый набор лунок, содержащих 500 мкл буфера общего оттока с желаемой концентрацией каждого препарата или без нее. Убедитесь, что не осталось лишнего буфера. Каждая лунка представляет n= 1 для экспериментальных условий. Каждое экспериментальное условие выполняется в трех экземплярах.
- Одна лунка содержит насыщенный кислородом буфер оттока, следующая 10-30 мкМ AMPH, а конечная лунка содержит 10-30 μМ AMPH плюс ингибиторы транспортировки моноаминов. Каждый препарат растворяют в кислородосодержащем буфере для оттока.
- Инкубировать ткань в течение 20 мин при 37 °C с 500 мкл лекарственного состояния.
заметка: Дополнительные лунки могут включать насыщенный кислородом буфер с высоким уровнем оттока K+ с ингибиторами транспортера моноаминов или без них. Растворите каждый препарат в насыщенном кислородом буфере для оттока (500 μл).
- Во время второй инкубации продолжительностью 20 мин соберите раствор из лунок из первой инкубации на стадии 1.2.1 и перенесите в микроцентрифужные пробирки, содержащие 50 мкл 1 Н хлорной кислоты или фосфорной кислоты (в зависимости от типа ВЭЖХ, конечная концентрация 0,1 Н). Итоговый объем образца составит 550 мкл. Держите микроцентрифужные пробирки на льду и маркируйте пробирки #1.
- После второй инкубации продолжительностью 20 мин переместите держатель салфеток с участками мозга или перфораторами в пустую лунку и удерживайте пластину на льду. Надосадочную жидкость перенести в микроцентрифужные пробирки, содержащие 50 мкл 1 Н хлорной кислоты или фосфорной кислоты. Конечный объем образца составит 550 мкл. Держите микроцентрифужные пробирки на льду и маркируйте пробирки #2.
- Добавьте 1 мл ледяного буфера для диссекции в каждую лунку, содержащую ткань. Соберите всю ткань с помощью маленького пинцета и переложите в чистые микроцентрифужные пробирки.
- Поддерживайте температуру трубок с тканью мозга при температуре -80 °C. Выбросьте 1 мл буфера для рассечения (рис. 1B4).
- Фильтруйте растворы, полученные при каждой инкубации, с помощью микроцентрифужных фильтрующих трубок (0,22 мкм) при плотности 2 500 x g в течение 2 мин. Используйте фильтрат для определения содержания моноаминов с помощью ВЭЖХ с электрохимическим детектированием (рис. 1B5).
