Все описанные здесь процедуры на животных были одобрены Медицинской школой Икана в Маунт-Синай, институциональным ядром и комитетом по использованию.
1. Подготовка перед выделением клапанных клеток от взрослых мышей
- Очистите и стерилизуйте все хирургические инструменты, показанные на рисунке 1A, используя 70% v/v этанола, а затем автоклавируйте их в течение 30 мин. Очистите хирургическое рабочее место 70% этанолом.
- Добавьте 500 мкл пенициллин-стрептомицина к 50 мл 10 мм HEPES. Приготовьте аликвоту из 50 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS). Держите растворы на льду.
- Приготовьте растворы коллагеназы 1 мг/мл и 4,5 мг/мл и используйте по 5 мл каждого раствора в 15 мл пробирок для выполнения всей процедуры. Для приготовления 5 мл 1 мг/мл коллагеназы смешайте 5 мг коллагеназы с 2,5 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM, без фетальной бычьей сыворотки (FBS)) и 2,5 мл 10 мл 10 мг HEPES с добавлением антибиотиков (1% пенициллин-стрептомицин из этапа 1.2). Отфильтруйте растворы через фильтр 0,22 мкм, чтобы удалить загрязнения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите растворы на льду, чтобы защитить ферменты.
- Нагрейте раствор DMEM до 37 °C перед использованием, выполнив все описанные ниже шаги. Приготовьте готовую среду, добавив DMEM 1% пенициллин-стрептомицина, 1% пирувата натрия, 5 мл 200 мМ L-глутамина, 1 мл реагента для элиминации микоплазмы (см. Таблицу материалов) и 10% FBS.
2. Изоляция клапанных ячеек
- Чтобы получить 105 клеток для эксперимента, используют пять 8-недельных мышей (минимум три). Поместите мышь в индукционную камеру вместе с небольшим кусочком папиросной бумаги, смоченным в 1 мл изофлурана, но не допускайте контакта с тканью. Подтвердить, что животное полностью обезболито; Проверьте наличие рефлекса защемления пальца ноги, а затем усыпьте мышь при шейном вывихе. Используйте изофлуран для облегчения боли до вывиха шейки матки, так как описанная ниже процедура является терминальной.
- Поместите мышь на препарирующую платформу, а лапы зафиксируйте канюлями, чтобы удержать ее на месте. Очистите грудь и брюшную полость этанолом; Раскройте живот и грудную клетку ножницами. Маленькими хирургическими ножницами разрежьте между левым предсердием и левым желудочком, чтобы обескровить мышь. Перфузируйте сердце 10 мл холода 1x PBS, чтобы удалить кровь из сердца.
- Разрежьте сердце и держитесь на расстоянии 3 мм от восходящей аорты, как показано на рисунке 1B. Рассеките аортальный клапан под стереомикроскопом. Разрежьте сердце горизонтально посередине желудочков (рисунок 1В). Разрежьте левый желудочек по направлению к аорте и осторожно рассеките аортальный клапан (рисунок 1D-F). Соедините клапаны вместе в небольшой чашке для культуры тканей диаметром 35 мм.
- Промойте выделенные клапаны в чашке для клеточных культур диаметром 75 мм 5 мл холодного HEPES (10 мМ) с добавлением антибиотиков (1% пенициллин-стрептомицина) для удаления крови (Рисунок 2). Приготовьте две пробирки по 15 мл коллагеназы 1 мг/мл и 4,5 мг/мл, как описано выше в шаге 1.3.
заметка: После вскрытия манипулируйте изолированными клапанами в стерильном биозащитном колпаке, чтобы свести к минимуму загрязнение.
- Инкубируйте клапаны в коллагеназе типа I (1 мг/мл) в течение 30 минут при 37 °C с непрерывным встряхиванием (Рисунок 2). Центрифугируйте пробирку в течение 5 минут при 150 × г, промойте гранулу один раз 2 мл HEPES (10 мМ) и перемешайте в течение 30 с на высокой скорости. Высыпьте содержимое этой пробирки в чашку для культуры диаметром 35 мм, а фрагменты ткани с помощью тонкого пинцета аккуратно перенесите в новую пробирку.
заметка: На этой стадии ВИК еще не диссоциированы от ткани, а гранула содержит кусочки ткани. Во избежание контаминации эндотелиальными клетками не следует центрифугировать после вортексирования на этапе 2.5.
- Инкубируйте гранулу в пробирке объемом 15 мл с 5 мл коллагеназы типа I (4,5 мг/мл) при 37 °C при непрерывном перемешивании в течение 35 мин. Повторно суспензируйте клетки с помощью пипетки объемом 1 мл, чтобы разделить клетки, и центрифугируйте при 150 × г в течение 5 мин при 4 °C.
- Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу в 2 мл полного DMEM. Центрифугируйте при 150 × г в течение 5 мин при 4 °C. Повторите этот шаг дважды><, чтобы очистить ячейки.
заметка: В грануле все еще будут присутствовать фрагменты ткани.
- Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл полной среды и поместите клетки в одну лунку 6-луночной чашки для культивирования клеток в минимальное количество среды, чтобы облегчить их прикрепление к чашке для культивирования. Оставьте клетки в покое в инкубаторе с температурой 37 °C и 5% углекислого газа.
- Через 3 дня проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться в хорошем росте рядом с остатками тканей. Как только под микроскопом будет видна 1000 клеток, осторожно удалите остатки ткани с помощью автоклавного пинцета и смените среду.
заметка: Плиту нельзя тревожить; Если нужного количества клеток не наблюдается, поместите чашку для клеточной культуры обратно в инкубатор еще на 2 дня.
- Когда клетки на 70% сливаются (2,5 × 105), трипсинизируйте и затем перенесите их в 75-миллиметровую чашку для культуры тканей.
3. Анализ кальцификации in vitro
- Очистите вытяжку 70% этанолом, нагрейте среду DMEM до 37 °C.
- Высевайте 100 000 клеток/кондиций в 6-луночные планшеты в полном DMEM и культивируйте в течение 24 ч при 37 °C.
- Готовят кальцифицирующую среду, смешивая 2 мМ2PO4, 10-7 М инсулина и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты в DMEM с 5% FBS. На 93 мл DMEM добавляют 5 мл FBS, 1 мл антибиотиков (конечная концентрация 1%), 1 мл пирувата натрия (100 мМ), 27,5 мг2PO4, 5,8 мкл инсулина и 5 мг аскорбиновой кислоты><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием отфильтруйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Через 24 часа замените надосадочную среду на кальцифицирующую. Инкубируйте клетки в течение 7 дней при 37 °C. На 3-й день замените свежей кальцифицирующей средой и поместите планшет обратно в инкубатор для завершения 7-дневного лечения.
- Через 7 дней удалите среду и дважды промойте клетки 2 мл 1x PBS. Инкубируйте клетки в 1 мл 0,6 Н соляной кислоты (HCl) в течение 24 ч при 37 °C. Соберите HCl в пробирку объемом 1,5 мл и выпарите его во вращающемся испарителе. Повторно суспендируйте содержимое всех пробирок в 60 мкл HCl.
заметка: При процедуре сушки важно концентрировать раствор и иметь одинаковый объем для каждого состояния.
- Используйте 96-луночный планшет для измерения концентрации кальция с помощью реагента Arsenazo III, доступного в готовом к использованию наборе (подробнее см. Таблица материалов).
- Приготовьте стандартный раствор кальция в концентрации 10 мг/дл. Смассируйте 10 мг гидроксида кальция (Ca(OH)2) и растворите в 100 мл дистиллированной воды.
- В прозрачный 96-луночный планшет пипетируйте 2 мкл пустого раствора (HCl, 0,6 N), стандартный раствор, образец на лунку (10 мг/дл) и образцы. Проведите эксперимент в трех экземплярах, чтобы проверить вариабельность пипетирования. Добавьте по 200 мкл реагента для каждого условия.
заметка: Образцы с концентрацией выше 15 мг/дл следует разбавить физиологическим раствором в соотношении 1:1, повторно проанализировать и умножить результат на два.
- Инкубируйте реакцию в течение 15 минут при комнатной температуре.
заметка: Реакция стабильна в течение 60 мин.
- Прочтите и запишите поглощение пластины при 650 нм. Используйте следующую формулу для расчета количества кальция в образцах:
Кальций (мг/мл) = (Абсорбция пробы/абсорбция стандарта) × Концентрация стандарта
