Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Отбор проб PM2.5 и экстракция органических соединений
ПРИМЕЧАНИЕ: PM2.5 был собран в городской местности в Сучжоу, Китай, 1-7 августа 2015 года, как описано ранее.
- Выпекать кварцевые мембранные фильтры диаметром 47 мм в муфельной печи при температуре 500 °C в течение 2 часов для удаления органических компонентов.
- Поместите фильтр в пробоотборник PM2.5 на 24 часа непрерывного отбора проб.
- Снимите фильтр и высушите в течение 24 часов при комнатной температуре.
- Количественное определение фильтра с помощью аналитических весов.
- Извлечение органических компонентов из фильтра методом Сокслета с использованием дихлорметана в качестве растворителя.
- Высушите EOM путем ротационного испарения на водяной бане при температуре 60 °C и потоком азота. Растворите ЭОМ в ДМСО и храните при температуре -20 °C.
2. Сбор и лечение эмбрионов рыбок данио-рерио
- Поддерживайте рыбок данио при температуре 28,5 ± 0,5 °C в рециркуляционной системе аквакультуры с 14-часовым световым и 10-часовым темным фотопериодическим циклом.
- Поместите здоровых взрослых рыбок данио в аквариум в соотношении самцов и самок 2:1.
- На следующий день соберите эмбрионы и промойте их системной водой (т.е. водой для разведения рыбок данио).
- Отбирают и случайным образом делят эмбрионы данио-рерио, демонстрирующие нормальное развитие (равномерный размер, полнозерные зерна и отсутствие свертываемости яиц) на 4 группы в отдельных стеклянных чашках Петри диаметром 7 см (около 50 эмбрионов на чашку).
- Обрабатывают эмбрионы PM2,5 (5 мг/л) в присутствии или отсутствии NAC в концентрации 0,25 мкМ от 2 hpf до 72 hpf. Используйте ДМСО в качестве средства контроля транспортного средства до конечной концентрации 0,1% (v/v).
3. Морфологическое наблюдение за эмбрионами данио-рерио и вскрытие сердца
- При 72 hpf перенесите эмбрионы на предметные стекла и наблюдайте под стереомикроскопом. Регистрируйте пороки развития сердца, такие как отек перикарда, измененная петля и уменьшение размера.
- Рассчитайте частоту пороков развития (процент эмбрионов с пороками сердца от общего числа живых эмбрионов) и проанализируйте различия между группами с помощью одностороннего метода ANOVA с последующим тестом множественного сравнения в Турции (p < 0,05 = статистически значимый).
- Обезболивайте эмбрионы 0,6 мг/мл MS-222, чтобы обездвижить их на предметных стеклах.
- Записывайте сердцебиение в течение 30 с и количественно измеряйте частоту сердечных сокращений с помощью программного обеспечения ImageJ.
- Препарируйте сердца эмбрионов рыбок данио с помощью одноразовой иглы шприца под стереомикроскопом. Внимание: Избегайте разрушения формы сердца.
4. Иммунофлуоресцентный анализ
- Чтобы использовать иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения индуцированного PM2,5 повреждения ДНК в сердце эмбрионов рыбок данио, используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать круг на чистой стеклянной стороне.
- Добавьте 50 мкл 4% параформальдегида к 1,25 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) для получения фиксирующего раствора.
- Поместите 3 рассеченных сердца в один круг с гидрофобным барьером и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Сцедите раствор под микроскоп и высушите образцы при комнатной температуре не менее 5 минут, чтобы сердечки полностью прикрепились к стеклянным предметным стеклам.
- Промойте предметные стекла три раза в PBS с 0,1% Tween 20 (PBST) в течение 5 минут за стирку.
- Добавьте 50 мкл бычьего сывороточного альбумина (БСА) к 1000 мкл ПБСТ для получения 5% раствора БСА и инкубируйте предметные стекла во влажной камере в течение 1 ч для блокирования связывания неспецифических антител.
- Сцедите раствор и трижды промойте образцы PBST в течение 5 минут за промывку.
- Разведите 2 мкл мышиного моноклонального антитела против 8-OHdG и 2 мкл кроличьего поликлонального антитела против γH2AX в 296 мкл PBST для получения рабочего первичного раствора коктейля антител.
- Инкубируйте образцы сердца с 50 мкл первичного раствора коктейля антител против 8-OHdG и γH2AX во увлажненной камере в течение не менее одного часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C (ночная инкубация может увеличить интенсивность сигнала).
- Сцедите раствор и трижды промойте образцы PBST в течение 5 минут за промывку.
- Разведите 1 мкл меченого FITC козьего вторичного антитела против мышей и 1 мкл вторичного антитела cy3 козьего против кролика в 498 мкл PBST для получения рабочего раствора коктейля вторичных антител и инкубируйте образцы с вторичными антителами (1:500 в PBST) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
- Сцедите раствор и трижды промойте образцы PBS в течение 5 мин за одну промывку в защищенном от света месте.
- Добавить 20 мкл DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) в образцы для ядерного окрашивания в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Нанесите покровное стекло на скольжение и запечатайте лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание и движение. Затем визуализируйте образцы под флуоресцентным микроскопом и количественно оцените флуоресцентный сигнал области сердца с помощью программного обеспечения ImageJ. Рассчитайте относительные изменения с помощью среднего значения контрольных образцов ДМСО. Определите статистическую значимость данных, как показано в шаге 3.2.
