$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление срезов коры головного мозга и гиппокампа
ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления срезов коры рида и гиппокампа используются крысы P6-7 Спрага-Доули.
- Завязка культуры и подготовка среды
- За день до посева подготовьте необходимые среды и поместите их при температуре 4 °C.
- Приготовьте среду для вскрытия: 25 мМ глюкозы в сбалансированном растворе соли Гея (GBSS).
- Приготовьте питательную среду: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% лошадиная сыворотка (HS), 25 мМ глюкозы, 30 мкг/мл гентамицина.
- Приготовьте поддерживающую среду: Нейробазал-А (НБА), 2% В27, 1 мМ L-глутамин, 30 мкг/мл гентамицина, ГС (15%, 10%, 5% и 0%).
- Сбор мозгов
- Непосредственно перед началом культивирования добавьте по 1,1 мл питательной среды в каждую лунку 6-луночного планшета с помощью пипетки P1000 и поместите его при температуре 37 °C.
- Поместите все оборудование (микроскоп для вскрытия, измельчитель тканей, лампу для препарирования, инструменты для препарирования, электроды, планшеты, вкладыши и фильтровальную бумагу) внутрь шкафа биологической безопасности и стерилизуйте под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут.
- Отрегулируйте толщину среза до 350 мкм.
- Достаньте ГБСС из холодильника. Добавьте 5 мл GBSS в шесть чашек Петри. На одно животное потребуется шесть чашек Петри.
- Усыпьте детеныша крысы. Выполните обезглавливание с помощью острых ножниц у основания ствола мозга животного.
- Трижды вымойте голову животного в холодном ГБСС и занесите внутрь защитного шкафа.
- Выделение тканей и подготовка ломтиков
- Плотно вставьте острые щипцы в глазницы, чтобы удерживать голову.
- С помощью тонких ножниц разрежьте кожу головы по средней линии, начиная от позвоночного отверстия по направлению к лобным долям, и отложите его в сторону.
- Разрежьте таким же образом череп и вдоль мозговой поперечной щели (пространство между мозгом и мозжечком). Изогнутыми длинными щипцами раздвиньте его.
- Выбросьте обонятельные луковицы с помощью шпателя. Извлеките мозг из головы и поместите его в ледяной ГБСС тыльной поверхностью вверх (рисунок 1А).
- Введите тонкие щипцы в мозжечок и двигайтесь по средней линии, очень осторожно открывая каждое полушарие шпателем (рисунок 1B).
- С помощью щипцов с коротким изгибом аккуратно удалите лишнюю ткань, покрывающую гиппокамп, не задевая структуру гиппокампа. Затем шпателем разрежьте ниже каждого гиппокампа (рисунок 1В).
- Возьмите одно полушарие и положите его гиппокампом вверх на фильтровальную бумагу. Повторите процедуру с другим полушарием и поместите его параллельно первому, в фильтровальную бумагу. Положите фильтровальную бумагу на измельчитель тканей полусферами перпендикулярно лезвию и разрежьте полусферы на срезы 350 мкм (рис. 1D).
- Поместите нарезанную ткань в чашку Петри с холодным GBSS (рисунок 1E).
- Аккуратно отделите срезы с помощью электродов с круглым концом (рис. 1F). Оставьте только срезы со структурно неповрежденной корой ринального головного мозга и гиппокампом. Области ДГ и СА должны быть идеально определены, а также энторинальная и периринальная кора (рисунок 1G).
- Поместите каждый срез на вкладыш (рис. 1H-I) с помощью шпателя и электрода с круглым наконечником. Удалите излишки диссекционной среды вокруг каждого среза с помощью пипетки P20 (рис. 1J). Четыре среза коры головного мозга и гиппокампа могут быть культивированы в одной вставке (рис. 1K).
- Уход за культурой
- Меняйте носитель через день.
- Прогрейте среду до 37 °C.
- Достаньте тарелки из инкубатора. Возьмите каждую вставку, удерживая пластиковый край щипцами (рис. 1L).
- Свободной рукой отсасывайте среду из лунки. Поместите вкладыш обратно в лунку и добавьте 1 мл с помощью пипетки P1000 свежей подогретой среды (рисунок 1M). Повторите для всех вставок. Убедитесь, что между мембраной и средой не застревают пузырьки воздуха.
заметка: Эпилептические срезы подвергаются постепенному и контролируемому лишению сыворотки в среде. Начиная с 9 дней в пробирке (DIV) срезы хранятся в NBA без HS.
2. Электрофизиологические записи
ПРИМЕЧАНИЕ: Электрофизиологические записи проводились в органотипических срезах коры головного мозга-гиппокампа при 7, 14 и 21 DIV в камере интерфейсного типа. Записи были получены с помощью усилителя, оцифрованы и проанализированы с помощью программного обеспечения. Все записи были подвергнуты полосовой фильтрации (восьмиполюсный фильтр Бесселя на частоте 60 Гц и фильтр Гаусса на частоте 600 Гц).
- Подготовка к настройке
- Приготовьте 50 мл среды NBA с 1 мл B27 и 250 мкл L-глутамина. Прогрейте до 37 °C.
- Установите электрофизиологическую установку в замкнутый контур. Проверьте, составляет ли скорость потока 2 мл/мин.
- Откройте клапан коробки автомобиля (5% CO2/95% O2) и проверьте уровень воды в системе.
- Поместите фильтровальную бумагу в камеру записи интерфейса, чтобы слить лишнюю среду, и бумагу для чистки объектива под оправой, чтобы подать среду на срез.
- Включите регулятор температуры, усилители и микроманипулятор.
- Перед началом записи дайте температуре в интерфейсной камере стабилизироваться на уровне 37 °C.
- Приготовьте искусственную спинномозговую жидкость (aCSF: 124 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 1,2 мМ2PO4, 25 мМ NaHCO3, 10 мМ глюкозу, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgSO4 с pH 7,4) и используйте ее для наполнения стеклянного электрода шприцем. Поместите его в приемный электрод.
- Записи спонтанной активности
- Как только температура стабилизируется, извлеките пластину из инкубатора и отрежьте один ломтик от вкладыша с помощью очень острого лезвия. Поместите его в тарелку диаметром 60 мм с каплей медиума. Поднесите его к камере записи интерфейса.
- Поместите срез в камеру сопряжения с гиппокампом внизу справа. Поместите принимающий электрод в слой пирамидальной ячейки CA3.
- Перейдите к протоколу непрерывного сбора данных и ведите запись в течение 30 минут.
