Методика записи эпилептиформной активности на основе электроэнцефалографии

Аннотация

Источник: Carvalho, M. et al., A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео описывает технику записи эпилептиформной активности органотипических срезов ринальной коры-гиппокампа ex vivo с использованием электрофизиологии или установки ЭЭГ. Это помогает изучать динамику и прогрессирование эпилептогенеза и проводить скрининг потенциальных терапевтических мишеней для лечения эпилепсии.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Приготовление срезов коры головного мозга и гиппокампа

ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления срезов коры рида и гиппокампа используются крысы P6-7 Спрага-Доули.

1. Завязка культуры и подготовка среды
   1. За день до посева подготовьте необходимые среды и поместите их при температуре 4 °C.
   2. Приготовьте среду для вскрытия: 25 мМ глюкозы в сбалансированном растворе соли Гея (GBSS).
   3. Приготовьте питательную среду: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% лошадиная сыворотка (HS), 25 мМ глюкозы, 30 мкг/мл гентамицина.
   4. Приготовьте поддерживающую среду: Нейробазал-А (НБА), 2% В27, 1 мМ L-глутамин, 30 мкг/мл гентамицина, ГС (15%, 10%, 5% и 0%).
2. Сбор мозгов
   1. Непосредственно перед началом культивирования добавьте по 1,1 мл питательной среды в каждую лунку 6-луночного планшета с помощью пипетки P1000 и поместите его при температуре 37 °C.
   2. Поместите все оборудование (микроскоп для вскрытия, измельчитель тканей, лампу для препарирования, инструменты для препарирования, электроды, планшеты, вкладыши и фильтровальную бумагу) внутрь шкафа биологической безопасности и стерилизуйте под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут.
   3. Отрегулируйте толщину среза до 350 мкм.
   4. Достаньте ГБСС из холодильника. Добавьте 5 мл GBSS в шесть чашек Петри. На одно животное потребуется шесть чашек Петри.
   5. Усыпьте детеныша крысы. Выполните обезглавливание с помощью острых ножниц у основания ствола мозга животного.
   6. Трижды вымойте голову животного в холодном ГБСС и занесите внутрь защитного шкафа.
3. Выделение тканей и подготовка ломтиков
   1. Плотно вставьте острые щипцы в глазницы, чтобы удерживать голову.
   2. С помощью тонких ножниц разрежьте кожу головы по средней линии, начиная от позвоночного отверстия по направлению к лобным долям, и отложите его в сторону.
   3. Разрежьте таким же образом череп и вдоль мозговой поперечной щели (пространство между мозгом и мозжечком). Изогнутыми длинными щипцами раздвиньте его.
   4. Выбросьте обонятельные луковицы с помощью шпателя. Извлеките мозг из головы и поместите его в ледяной ГБСС тыльной поверхностью вверх (рисунок 1А).
   5. Введите тонкие щипцы в мозжечок и двигайтесь по средней линии, очень осторожно открывая каждое полушарие шпателем (рисунок 1B).
   6. С помощью щипцов с коротким изгибом аккуратно удалите лишнюю ткань, покрывающую гиппокамп, не задевая структуру гиппокампа. Затем шпателем разрежьте ниже каждого гиппокампа (рисунок 1В).
   7. Возьмите одно полушарие и положите его гиппокампом вверх на фильтровальную бумагу. Повторите процедуру с другим полушарием и поместите его параллельно первому, в фильтровальную бумагу. Положите фильтровальную бумагу на измельчитель тканей полусферами перпендикулярно лезвию и разрежьте полусферы на срезы 350 мкм (рис. 1D).
   8. Поместите нарезанную ткань в чашку Петри с холодным GBSS (рисунок 1E).
   9. Аккуратно отделите срезы с помощью электродов с круглым концом (рис. 1F). Оставьте только срезы со структурно неповрежденной корой ринального головного мозга и гиппокампом. Области ДГ и СА должны быть идеально определены, а также энторинальная и периринальная кора (рисунок 1G).
   10. Поместите каждый срез на вкладыш (рис. 1H-I) с помощью шпателя и электрода с круглым наконечником. Удалите излишки диссекционной среды вокруг каждого среза с помощью пипетки P20 (рис. 1J). Четыре среза коры головного мозга и гиппокампа могут быть культивированы в одной вставке (рис. 1K).
4. Уход за культурой
   1. Меняйте носитель через день.
   2. Прогрейте среду до 37 °C.
   3. Достаньте тарелки из инкубатора. Возьмите каждую вставку, удерживая пластиковый край щипцами (рис. 1L).
   4. Свободной рукой отсасывайте среду из лунки. Поместите вкладыш обратно в лунку и добавьте 1 мл с помощью пипетки P1000 свежей подогретой среды (рисунок 1M). Повторите для всех вставок. Убедитесь, что между мембраной и средой не застревают пузырьки воздуха.
      заметка: Эпилептические срезы подвергаются постепенному и контролируемому лишению сыворотки в среде. Начиная с 9 дней в пробирке (DIV) срезы хранятся в NBA без HS.

2. Электрофизиологические записи

ПРИМЕЧАНИЕ: Электрофизиологические записи проводились в органотипических срезах коры головного мозга-гиппокампа при 7, 14 и 21 DIV в камере интерфейсного типа. Записи были получены с помощью усилителя, оцифрованы и проанализированы с помощью программного обеспечения. Все записи были подвергнуты полосовой фильтрации (восьмиполюсный фильтр Бесселя на частоте 60 Гц и фильтр Гаусса на частоте 600 Гц).

1. Подготовка к настройке
   1. Приготовьте 50 мл среды NBA с 1 мл B27 и 250 мкл L-глутамина. Прогрейте до 37 °C.
   2. Установите электрофизиологическую установку в замкнутый контур. Проверьте, составляет ли скорость потока 2 мл/мин.
   3. Откройте клапан коробки автомобиля (5% CO₂/95% O₂) и проверьте уровень воды в системе.
   4. Поместите фильтровальную бумагу в камеру записи интерфейса, чтобы слить лишнюю среду, и бумагу для чистки объектива под оправой, чтобы подать среду на срез.
   5. Включите регулятор температуры, усилители и микроманипулятор.
   6. Перед началом записи дайте температуре в интерфейсной камере стабилизироваться на уровне 37 °C.
   7. Приготовьте искусственную спинномозговую жидкость (aCSF: 124 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 1,2 мМ₂PO₄, 25 мМ NaHCO₃, 10 мМ глюкозу, 2 мМ CaCl₂, 1 мМ MgSO₄ с pH 7,4) и используйте ее для наполнения стеклянного электрода шприцем. Поместите его в приемный электрод.
2. Записи спонтанной активности
   1. Как только температура стабилизируется, извлеките пластину из инкубатора и отрежьте один ломтик от вкладыша с помощью очень острого лезвия. Поместите его в тарелку диаметром 60 мм с каплей медиума. Поднесите его к камере записи интерфейса.
   2. Поместите срез в камеру сопряжения с гиппокампом внизу справа. Поместите принимающий электрод в слой пирамидальной ячейки CA3.
   3. Перейдите к протоколу непрерывного сбора данных и ведите запись в течение 30 минут.

Результаты

Рисунок 1: Подробная процедура приготовления органотипических срезов коры головного мозга и гиппокампа. (А) Удалите мозг из головы и поместите его в ледяной ГБСС тыльной поверхностью вверх. (В) Введите щипцы в мозжечок. Откройте мозг по средней линии и удалите лишнюю ткань над гиппокампом. (В) Шпателем разрежьте ниже гиппокампа, как указано стрелками...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Искусственная спинномозговая жидкость (КСФ)			самодельный
Добавка B-27™ (50X), без сыворотки	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Лезвия для рукоятки скальпеля	Инструменты для точной науки	10011-00
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	NZYTech	MB04602	5% БСА используется для разбавления первичных антител. Добавьте 0,5 г BSA в 10 мл PBS.
Система камер для среза мозга и тканей	Уорнер Инструментс
Вкладыши для клеточных культур, 30 мм, гидрофильный ПТФЭ	Миллипор САС	PICM03050
Обычный инкубатор	Компания Thermo Scientific Heraeus	BB15, Функциональная линия	Установите на 37 °C и 5% CO2
Сбалансированный солевой раствор Гея (GBSS)	Биологическая промышленность	01-919-1А
Стеклянные электроды	Научная продукция	ГБ150Ф-10	Круглые кончики самодельные
Интерфейсная камера	Уорнер Инструментс	BSC-HT Топ Haas
Ирисовый шпатель изогнутый	Инструменты для точной науки	10092-12
Бумага для чистки объектива	ТИФФЕН
L-раствор глютамина 200 мМ (Q)	Thermo Fisher Scientific	25030-024 (Английский)
Измельчитель тканей	Микл Лаборатория Инжиниринг CO. LTD.	ВТС/2	Установите значение 350 μм