Анализ смерти нейронов для оценки гибели клеток в модели эпилепсии ex vivo

Аннотация

Источник: Карвальо, М., и др., Модель эпилептогенеза в органотипических культурах срезов коры головного мозга и гиппокампа. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует технику оценки гибели нейронов в органотипических срезах ринальной коры-гиппокампа. Гибель нейронов происходит в результате развивающихся эпилептических припадков, напоминающих эпилепсию in vivo, и обнаруживается путем двойного окрашивания мертвых клеток с использованием йодида пропидиума и иммунофлуоресценции.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Приготовление срезов коры головного мозга и гиппокампа

ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления срезов коры рида и гиппокампа используются крысы P6-7 Спрага-Доули.

1. Завязка культуры и подготовка среды
   1. За день до посева подготовьте необходимые среды и поместите их при температуре 4 °C.
   2. Приготовьте среду для вскрытия: 25 мМ глюкозы в сбалансированном растворе соли Гея (GBSS).
   3. Приготовьте питательную среду: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% лошадиная сыворотка (HS), 25 мМ глюкозы, 30 мкг/мл гентамицина.
   4. Приготовьте поддерживающую среду: Нейробазал-А (НБА), 2% В27, 1 мМ L-глутамина, 30 мкг/мл гентамицина, ГС (15%, 10%, 5% и 0%).
2. Сбор мозгов
   1. Непосредственно перед началом культивирования добавьте по 1,1 мл питательной среды в каждую лунку 6-луночного планшета с помощью пипетки P1000 и поместите его при температуре 37 °C.
   2. Поместите все оборудование (микроскоп для вскрытия, измельчитель тканей, лампу для препарирования, инструменты для препарирования, электроды, планшеты, вкладыши и фильтровальную бумагу) внутрь шкафа биологической безопасности и стерилизуйте под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут.
   3. Отрегулируйте толщину среза до 350 мкм.
   4. Достаньте ГБСС из холодильника. Добавьте 5 мл GBSS в шесть чашек Петри. На одно животное потребуется шесть чашек Петри.
   5. Усыпьте детеныша крысы. Выполните обезглавливание с помощью острых ножниц у основания ствола мозга животного.
   6. Трижды вымойте голову животного в холодном ГБСС и занесите внутрь защитного шкафа.
3. Выделение тканей и подготовка ломтиков
   1. Плотно вставьте острые щипцы в глазницы, чтобы удерживать голову.
   2. С помощью тонких ножниц разрежьте кожу головы по средней линии, начиная от позвоночного отверстия по направлению к лобным долям, и отложите его в сторону.
   3. Разрежьте таким же образом череп и вдоль мозговой поперечной щели (пространство между мозгом и мозжечком). Изогнутыми длинными щипцами раздвиньте его.
   4. Выбросьте обонятельные луковицы с помощью шпателя. Извлеките мозг из головы и поместите его в ледяной ГБСС тыльной поверхностью вверх (Рисунок 1А).
   5. Введите тонкие щипцы в мозжечок и двигайтесь по средней линии, очень осторожно открывая каждое полушарие шпателем (рисунок 1B).
   6. С помощью щипцов с коротким изгибом аккуратно удалите лишнюю ткань, покрывающую гиппокамп, не задевая структуру гиппокампа. Затем шпателем разрежьте ниже каждого гиппокампа (рисунок 1В).
   7. Возьмите одно полушарие и положите его гиппокампом вверх на фильтровальную бумагу. Повторите процедуру с другим полушарием и поместите его параллельно первому, в фильтровальную бумагу. Положите фильтровальную бумагу на измельчитель тканей полусферами перпендикулярно лезвию и разрежьте полусферы на ломтики 350 мкм (Рисунок 1D).
   8. Поместите нарезанную ткань в чашку Петри с холодным ГБСС (рисунок 1E).
   9. Осторожно отделите срезы с помощью электродов с круглым концом (Рисунок 1F). Оставьте только срезы со структурно неповрежденной корой ринального головного мозга и гиппокампом. Области ДГ и СА должны быть идеально определены, а также энторинальная и периринальная кора (рисунок 1G).
   10. Поместите каждый срез на вставку (Рисунок 1H-I) с помощью шпателя и электрода с круглым наконечником. Удалите излишки диссекционной среды вокруг каждого среза с помощью пипетки P20 (рис. 1J). Четыре среза коры рида и гиппокампа могут быть культивированы в одной вставке (рис. 1K).
4. Уход за культурой
   1. Меняйте носитель через день.
   2. Прогрейте среду до 37 °C.
   3. Достаньте тарелки из инкубатора. Возьмите каждую вставку, удерживая пластиковый край щипцами (Рисунок 1L).
   4. Свободной рукой отсасывайте среду из лунки. Поместите вкладыш обратно в лунку и добавьте 1 мл с помощью пипетки P1000 свежей подогретой среды (Рисунок 1M). Повторите для всех вставок. Убедитесь, что между мембраной и средой не застревают пузырьки воздуха.
      заметка: Эпилептические срезы подвергаются постепенному и контролируемому лишению сыворотки в среде. Начиная с 9 дней в пробирке (DIV) срезы хранятся в NBA без HS.

2. Анализ поглощения PI

ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная смерть оценивалась путем мониторинга клеточного поглощения флуоресцентного красителя йодида пропидия (PI). ПИ представляет собой полярное соединение, которое проникает в клетки с поврежденными клеточными мембранами и взаимодействует с ДНК, излучая красную флуоресценцию (поглощение 493 нм, излучение 630 нм). Поскольку ПИ не относится к живым клеткам, она используется для обнаружения мертвых клеток в популяции.

1. Инкубация PI
   1. Приготовьте в питательной среде свежее разведение бульона PI в соотношении 1:10.
   2. Для анализа поглощения PI извлеките планшет из инкубатора и осторожно поднимите вкладыш. Добавьте 13 μL PI в среду с помощью пипетки P20, получая конечную концентрацию 2 μM. Медленно перемешивайте планшет перед тем, как вернуть вставку на место. Убедитесь, что под ломтиками нет пузырьков.
   3. Поместите ломтики обратно в инкубатор при температуре 37 °C на 2 часа.
   4. Приступайте к протоколу иммуногистохимии, как описано в следующем разделе. Накройте пластины алюминием, так как PI светочувствительна.

3. Иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: В иммуногистохимии нейрон-специфическое антитело, а также антитела, способные различать покоящиеся и реактивные фенотипы микроглии и астроцитов, были использованы для оценки степени гибели нейронов и глиоза в эпилептических органотипических срезах ринальной коры-гиппокампа.

1. Фиксация тканей
   1. Достаньте тарелку из инкубатора и отсадите среду. Зафиксируйте срезы с помощью 4% параформальдегида (PFA) на 1 ч при RT, добавив 1 мл PFA под и над срезами с помощью пипетки P1000.
   2. Удалите PFA и добавьте 1 мл PBS. Также добавьте PBS под ломтиками и над ними.
   3. Храните ломтики при температуре 4 °C, в PBS, до дальнейшего использования. Всегда наклеивайте на пластины парапленку, чтобы избежать высыхания.
2. Этапы иммуноокрашивания
   1. Умыться дважды, каждый раз по 10 минут, с 1 мл PBS.
   2. Приготовьте раствор для пермеабилизации/блокирования, содержащий 1% Triton-X100, 10% HS и 10% BSA в PBS. Приготовьте 5% раствор БСА.
   3. Нарисуйте два прямоугольника с помощью гидрофобного пера (Рисунок 2А). Отрежьте ломтики от вкладыша (Рисунок 2B) очень острым лезвием. Поместите по два среза на предметное стекло (рис. 2C) и добавьте 140 μл раствора для пермеабилизации/блокировки на верхнюю часть каждого среза с помощью пипетки P200. Инкубировать в течение 3 ч при RT.
   4. Развести первичные антитела к рабочему разведению в 5% БСА в PBS. Инкубировать с первичными антителами в течение ночи при температуре 4 °C.
   5. Инкубировать со вторичными антителами в течение 4 ч при ЛТ. Начиная с этого шага, защищайте пластину от света, так как работают с флуорофорами.
   6. Нанесите каплю раствора Хёхста объемом 50 мкл на верхнюю часть каждого ломтика и инкубируйте в течение 20 минут при RT.
   7. Промывайте между инкубациями. Всегда стирайте три раза, каждый раз по 10 минут, с PBS-T.
   8. Снимите Hoechst и вымойте в соответствии с рекомендациями.
   9. Добавьте 50 μL монтажной среды на верхнюю часть каждого ломтика. Накройте стеклянным покровным стеклом и обложите ногтями лаком (Рисунок 2D).
   10. Дайте высохнуть при RT в течение 24 часов.
   11. Визуализируйте иммуноокрашивание под конфокальным микроскопом. Храните окрашенные ломтики при температуре -20 °C.

Результаты

Рисунок 1: Подробная процедура приготовления органотипических срезов коры головного мозга и гиппокампа. (А) Извлеките мозг из головы и поместите его в ледяной ГБСС тыльной поверхностью вверх. (В) Введите щипцы в мозжечок. Откройте мозг по средней линии и удалите лишнюю ткань над гиппокампом. (В) Шпателем разрежьте ниже гиппокампа, как указано стрелками. (D) Положите...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Центрифужная пробирка 50 мл, коническое дно	Корнинг	430829
70% этанол	Мануэль Виейра, Lda	ООН1170
Anti-NeuN (кролик)	Верфен	16712943С	Разводить в соотношении 1:500
Добавка B-27™ (50X), без сыворотки	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Лезвия для рукоятки скальпеля	Инструменты для точной науки	10011-00
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	NZYTech	MB04602	5% БСА используется для разбавления первичных антител. Добавьте 0,5 г BSA в 10 мл PBS.
Система камер для среза мозга и тканей	Уорнер Инструментс
Вкладыши для клеточных культур, 30 мм, гидрофильный ПТФЭ	Миллипор САС	PICM03050
Источник холодного света	ШОТТ	KL 300 LED
Конфокальный лазерный микроскоп	Цейсс	ЛСМ 710
Обычный инкубатор	Компания Thermo Scientific Heraeus	BB15, Функциональная линия	Установите на 37 °C и 5% CO2
D(+)-Моногидрат глюкозы	Мерк Миллипор	1.08342.1000
D-(+)-раствор глюкозы, 45% в воде	сигма	Г8769
дигидрат гидрофосфата натрия	Merck Milipore	1.06580.1000
Препарирующий микроскоп/лупа	МЭЙДЗИ ТЕХНО КО., ЛТД	122285
Ослиный антикроличий IgG (H+L) в сочетании с Alexa Fluor 488	Инвитроген	А21206	Разводить в соотношении 1:500
Dumont #5 Тонкие щипцы Biologie Inox	Инструменты для точной науки	11254-20
Dumont #5 Щипцы стандартные из нержавеющей стали	Инструменты для точной науки	11251-20
Dumont #7 Щипцы стандартные Dumoxel	Инструменты для точной науки	11271-30
Dumont Medical #7S щипцы с короткой кривой из нержавеющей стали	Инструменты для точной науки	11273-22
Исходный раствор гентамицина, 50 мг/мл	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Сбалансированный солевой раствор Гея (GBSS)	Биологическая промышленность	01-919-1А
Стеклянные электроды	Научная продукция	ГБ150Ф-10	Круглые кончики самодельные
Стеклянные пастеровские пипетки, 230 мм	VWR Интернэшнл	612-1702
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	No 24020-091
Лошадиная сыворотка, инактивированная при нагревании (HS)
соляная кислота	Thermo Fisher Scientific	26050-088
Гидрофобная ручка	Merck Milipore	1.09057.1000
INCU-Line IL10	Дако	S200230-2
Ирисовый шпатель изогнутый	Уорнер Инструментс	BSC-HT Топ Haas
Шкаф биологической безопасности Labculture класса II	Инструменты для точной науки	10092-12
Бумага для чистки объектива	HERASafe	ТН ВЭД 12
L-раствор глютамина 200 мМ (Q)	ТИФФЕН
Микропробирка 0,5 мл, PP	Мерк Миллипор	1.05886.0500
Микропробирка 1,5 мл, PP	САРШТЕДТ	72 699
Микропробирка 2,0 мл, PP	САРШТЕДТ	72.690.001
Защитные стекла Miroscope, 24 мм x 60 мм	Инструмент Саттера	МП-285
лак	Мариенфельд	102242
Нейробазал-А среда (НБА)	клише
Opti-MEM® I Средство для пониженной сыворотки	Thermo Fisher Scientific	10888-022
Параформальдегид, порошок	Thermo Fisher Scientific	31985-047 (Английский)
Перистальтический насос	VWR Химикаты	2,87,94,295
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Гилсон	М312
Стандартные растворы фосфатов, РО43- в воде			самодельный. PBS с 0,5% Tween-20 (PBS-T) используется для промывки срезов при иммуногистохимическом анализе.
Набор пипеток	BDH ARISTAR	452232С
Лезвия из платины 5	Гилсон	П2, П10, П20, Р100, Р200, Р1000
Йодид пропидия (PI)	Сигма-Олдрич	P5405-250г
Качественная фильтровальная бумага, целлюлоза, Grade 1, 55 мм	Сигма-Олдрич	П4170-25МГ	Запасной раствор в концентрации 1 мг/мл в воде.
Качественная фильтровальная бумага, целлюлоза, Grade 1, 90 мм	ватман	1001-055	Среднее удержание 11μм
Рукоятка скальпеля	ватман	1001-090	Среднее удержание 11μм
Инсулиновый шприц с скользящим наконечником без иглы 1 мл	Инструменты для точной науки	91003-12
Студенческие ножницы прямые SharpSharp 12см	Группа продуктов Astro Med Inc GRASS	Стимулятор S48
Адгезионные горки SuperFrost Plus™	Инструменты для точной науки	91402-12
TC-обработанная стерильная чашка для культивирования тканей 60 x 15 мм	Thermo Fisher Scientific	J1800AMNZ
Стерильные 6-луночные планшеты, обработанные TC	Корнинг	CORN430166
Измельчитель тканей	КОРПОРАЦИЯ «МЕДИКАЛ СИСТЕМС»	ТК-102
Тритон Х-100	Микл Лаборатория Инжиниринг CO. LTD.	ВТС/2	Установите значение 350 μм
Подросток-20	BDH	14630
	сигма	П2287

гг. гг.