Анализ агрегации PolyQ для определения нейропротекторного действия соединения у червей

Аннотация

Источник: Wang, Q. et al. Caenorhabditis elegans в качестве модельной системы для открытия биоактивных соединений против полиглутамин-опосредованной нейротоксичности. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео описывает метод in vivo для скрининга защитного потенциала нейропротекторных тестовых соединений в снижении агрегации polyQ в мышечных клетках стенки тела нематод и улучшении протеотоксичности, связанной с агрегацией.

Протокол

1. Агрегационный анализ PolyQ

1. Получение нематод для анализа агрегации polyQ
   1. Перенесите 300-500 синхронизированных личинок L1 AM141 в каждую лунку 48-луночного планшета с 500 мкл S-среды, содержащей OP50 (OD₅₇₀ 0,7-0,8) и 5 мг/мл астрагалана, обычно по одной лунке на обработку в течение одного временного момента.
   2. Запечатайте планшет парапленкой и инкубируйте при температуре 20 °C и 120 об/мин в течение 24, 48, 72 и 96 часов.
   3. Соберите нематод в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и промойте буфером M9 >3 раза центрифугированием (1000 × г в течение 1 мин) для удаления оставшегося OP50. Восстановите суспендию нематод AM141 в буфере M9 и держите их готовыми к получению изображений.
2. Получение флуоресцентных изображений и анализ данных
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данные автоматически анализируются с помощью этой системы визуализации с высоким содержанием содержимого. Если автоматизированное устройство визуализации недоступно, можно использовать традиционный метод подготовки агарозной прокладки для получения изображения для достижения аналогичных характеристик с помощью обычного флуоресцентного микроскопа.
   1. Перенесите по 10-15 нематод в каждую лунку в планшете на 384 лунки (конечный объем 80 мкл на лунку). Установите 10 повторяющихся лунок для каждой обработки.
   2. Добавьте в каждую лунку по 10 мкл 200 мМ азида натрия, чтобы парализовать нематод и дать им осесть на дно (5-10 мин).
   3. Поместите пластину в систему визуализации с высоким содержанием жидкости для получения флуоресцентных изображений (информацию об устройстве и программном обеспечении см. в Таблице материалов).
   4. Откройте программу для получения изображений и настройте следующие параметры.
      1. Откройте окно Plate Acquisition Setup и создайте новый набор экспериментов и имя.
      2. Выберите Увеличение как 2x, Объединение камер как 1 и Тип пластины как 384-луночная пластина.
      3. Определите скважины и участки (один участок), которые необходимо посетить.
      4. Выберите фильтр флуоресцеина изотиоцианата (FITC) и включите параметры фокусировки на основе изображения.
      5. Установите Экспозицию (Exposure) на 300 мс.<бр/> заметка: Вышеуказанные настройки могут быть протестированы и отрегулированы для оптимизации параметров изображения.
      6. Сохраните настройки получения изображения и нажмите кнопку «Получить пластину» для запуска.
   5. Анализируйте данные изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
      1. Откройте окно «Просмотреть данные пластины» и выберите тестовую пластину для анализа изображения.
      2. Дважды щелкните по тестовой лунке, чтобы отобразить ее изображение.
      3. Выберите Count Nuclees в качестве метода анализа и нажмите кнопку Configure Settings, чтобы открыть окно для следующих настроек.
      4. Определите исходное изображение из канала FITC и выберите стандартный алгоритм.
      5. Установите следующие параметры анализа изображения: приблизительная минимальная ширина = 10 μм (= 2 пикселя); приблизительная максимальная ширина = 50 μм (= 12 пикселей); интенсивность над локальным фоном = 1000-2000 уровней серого.
      6. Протестируйте текущие настройки для оптимизации метода анализа.
      7. Сохраните настройки и запустите анализ по всем скважинам.
         заметка: Для завершения анализа одного 384-луночного планшета требуется ~20 минут.
      8. Экспортируйте общее количество ядер в виде общего числа агрегатов Q40::YFP в каждой скважине.
   6. Посчитайте количество нематод в каждой лунке.
   7. Вычислите среднее количество агрегатов Q40::YFP на нематоду в каждой группе и примените подгонку нелинейной кривой к данным из каждой временной точки.
   8. Рассчитать индекс торможения:
      Индекс торможения = (N_{контроль} - N_{образец}) / Ncontrol
      Где N_{контроля} и N_{выборки} — среднее количество агрегатов Q40::YFP в контрольной и лечебной группах соответственно.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Штамм C. elegans
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]	Центр генетики ценорхабдита (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
Штамм кишечной палочки
ОП50	Центр генетики ценорхабдита (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
реагент
Азид натрия	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
оборудование
384-луночный планшет для клеточных культур	Нест Биотехнология Ко., Лтд.	761001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=ru&product_id=85
48-луночный планшет для клеточных культур	Нест Биотехнология Ко., Лтд.	748001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=ru&product_id=85
Флуоресцентный микроскоп	Гуанчжоу Микро-Shot Оптическая Технология Ко., Лтд.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/ article/442.html
Система визуализации с высоким содержанием	Молекулярные приборы	Принтер ImageXpress	https://www.moleculardevices.com/ products/cellular-imagingsystems#High-Content-Imaging
Микроцентрифуга	Генная компания	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/ index.php/Главная/Товары/ goodsdetails/gid/189.html
Парапленка М	Сигма-Олдрич	П7793-1ЭА	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Микроскоп цифровой фотоаппарат	Гуанчжоу Микро-Shot Оптическая Технология Ко., Лтд.	МС60	https://www.mshot.com/article/677.html
программное обеспечение
Программное обеспечение для получения и анализа изображений	Молекулярные приборы	МетаКспресс	https://www.moleculardevices.com/ продукты/системы сотовой визуализации/ программное обеспечение для сбора и анализа/ metaxpress