Методическая статья

Анализ влияния тестируемого соединения на полиQ-опосредованную нейротоксичность у червей

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Wang, Q. et al., Caenorhabditis elegans как модельная система для открытия биоактивных соединений против полиглутамин-опосредованной нейротоксичности. J. vis. Exp. (2021)

В этом видео мы описываем метод оценки нейропротекторного эффекта тестируемого соединения, астрагалана, на выживаемость нейронов у Caenorhabditis elegans от полиQ-опосредованной нейротоксичности. В анализе используются Caenorhabditis elegans, экспрессирующие аномально расширенные полиQ-повторы, слитые с GFP в их нейронах ASH, для измерения выживаемости нейронов после лечения тестовым соединением.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. PolyQ-опосредованный анализ нейротоксичности

  1. Лечение C. elegans тестовыми образцами
    1. Для получения нематод для анализа нейротоксичности polyQ переносят 300-500 синхронизированных личинок L1 HA759 в каждую лунку 48-луночного планшета с 500 мкл среды S, содержащей OP50 (OD570 0,7-0,8) и 5 мг/мл астрагалана; обычно три повторяющиеся лунки для каждой обработки.
    2. Запечатайте пластину парапленкой и выдерживайте при температуре 15 °C и 120 об/мин в течение 3 дней.
    3. Соберите нематод центрифугированием и промойте 3-5 раз буфером М9. Ресуспендируйте нематоды в буфере M9 для использования в анализах выживаемости нейронов и предотвращения.
  2. Приготовление агарозной подушечки
    1. Добавьте 2 г агарозы в 100 мл буфера M9 (2% мас./об.) и нагрейте раствор агарозы в микроволновой печи до состояния, близкого к кипению.
    2. Нанесите 0,5 мл расплавленной агарозы на центр предметного стекла толщиной 1 мм для микроскопии, помещенного между двумя стеклянными пластинами толщиной 2 мм. Накройте еще одной горкой вертикально. Как только агароза остынет и застынет, аккуратно снимите верхнее предметное стекло.
  3. Анализ выживаемости нейронов ASH
    1. Добавьте каплю 20 мМ азида натрия на агарозную подушечку. Перенесите в каплю 15-20 нематод HA759, чтобы обездвижить их.
    2. Аккуратно накройте нематод покровной стеклом. Держите предметное стекло под флуоресцентным микроскопом, оснащенным цифровой камерой. Выберите объектив с 40-кратным увеличением и фильтр FITC для обнаружения GFP-положительных нейронов ASH в области головы нематод.
    3. Выберите более 50 нематод в каждой группе случайным образом, чтобы подсчитать количество нематод с GFP-мечеными двусторонними нейронами ASH в области головы. Рассчитать выживаемость нейронов ASH:
      Выживаемость нейронов (%) = figure-protocol-1
      Где Nвыживаемость иN total — количество нематод с GFP-положительными нейронами ASH и общее количество испытуемых нематод в каждой группе соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Штамм C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]Центр генетики ценорхабдита (CGC)https://cgc.umn.edu/strain/HA759
Штамм кишечной палочки
ОП50Центр генетики ценорхабдита (CGC)https://cgc.umn.edu/strain/OP50
реагент
агарозаБиозападNo 111860
Азид натрияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80115560https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af
551e96ff5f07cd
оборудование
48-луночный планшет для клеточных культурНест Биотехнология Ко., Лтд.748001https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Флуоресцентный микроскопГуанчжоу Микро-Shot Оптическая Технология Ко., Лтд.Mshot MF31-LEDhttps://www.mshot.com/article/442.html
Система визуализации с высоким содержаниемМолекулярные приборыImageXpress Picohttps://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
МикроцентрифугаГенная компанияGENESPEED X1https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Микроскоп цифровой фотоаппаратГуанчжоу Микро-Shot Оптическая Технология Ко., Лтд.МС60https://www.mshot.com/article/677.html
микроволновыйКорпорация Midea М1-211Аhttps://www.midea.cn/10000/10000000001
Парапленка МСигма-ОлдричП7793-1ЭАhttps://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
программное обеспечение
Программное обеспечение для получения и анализа изображенийМолекулярные приборыМетаКспрессhttps://www.moleculardevices.com/ продукты/системы сотовой визуализации/ программное обеспечение для сбора и анализа/ metaxpress

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Caenorhabditis elegansASHGFP

Похожие статьи