Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу 1 для рецептов решений, используемых в этом протоколе.
1. Подготовка материалов для анализа на Caenorhabditis elegans
- Поддержание штаммов C. elegans
- Получите штаммы C. elegans (AM141 и HA759) и Escherichia coli (OP50 и NA22) (см. Таблицу материалов).
- Поддерживайте содержание нематод на пластине с нематодами для роста (NGM), засеянной E. coli OP50, при температуре 20 °C для AM141 или 15 °C для HA759.
- Приготовление бактериальной культуры E. coli OP50
- Выберите одну колонию E. coli OP50 из полосовой пластины Лурии-Бертани (LB) и инокулируйте ее в 50 мл жидкой культуры LB.
- Инкубируйте бактерии OP50 в шейкере при 37 °C и 200 об/мин до оптической плотности ~0,5 при 570 нм (OD570).
- Храните бактериальную культуру OP50 при температуре 4 °C и используйте в течение двух недель.
- Подготовка планшетов NGM с бактериями OP50
- Добавьте 20 г агара, 2,5 г пептона, 3,0 г NaCl и 975 мл деионизированной воды в автоклавируемую бутылку объемом 1 л. Автоклав при 121 °C в течение 30 мин.
- Поставьте флакон с жидким агаром NGM на стол для охлаждения до ~60 °C, а затем добавьте следующие стерильные исходные растворы: 1 мл 1 М CaCl2, 1 мл 1 М MgSO4, 1 мл 5 мг/мл холестерина и 25 мл 1 М фосфата калия (pH 6,0).
- Налейте 20 мл NGM в стерильную чашку Петри диаметром 90 мм и оставьте пластины на столе для остывания и застывания. Держите тарелки вверх дном и дайте им высохнуть на скамейке при комнатной температуре в течение 2 суток.
- Нанесите 200 мкл бактериальной культуры OP50 на каждую чашку NGM и равномерно распределите стерильным стержнем для стеклянного покрытия. Закройте крышки и инкубируйте тарелки в течение ночи при температуре 37 °C.
- Храните планшеты NGM, засеянные OP50, в пластиковой коробке с крышкой при комнатной температуре и используйте в течение двух недель.
- Подготовка синхронизированной по возрасту популяции C. elegans
- Собрать взрослых нематод в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировать при 1000 × г в течение 1 мин. Трижды промыть и повторно суспендировать нематод в буфере М9.
- Добавьте равный объем раствора отбеливателя и осторожно перемешивайте в течение 3-5 мин. Контролируйте отбеливание каждые 15 с под препарирующим микроскопом.
заметка: Раствор отбеливателя перед использованием должен быть приготовлен свежим путем смешивания равных объемов 10% NaOCl и 1 М NaOH (Таблица 1).
- Как только большая часть нематод будет уничтожена, остановите переваривание, разбавив буфером M9. Быстро центрифугируйте для удаления надосадочной жидкости и повторно суспендируйте гранулу в буфере M9, чтобы повторить промывку три раза.
- Ресуспендируйте гранулу в среде S. Дайте остаткам нематоды осесть под действием силы тяжести в течение 2-3 минут, пока яйца остаются в надосадочной жидкости.
- Аспирируйте надосадочную жидкость в новую стерильную микроцентрифужную пробирку. Соберите яйца центрифугированием при 1000 × г в течение 1 мин.
- Выбросьте ~80% надосадочной жидкости и переложите яйца в стерильную колбу, содержащую 20 мл S-среды. Поместите колбу в шейкер и инкубируйте яйца в течение ночи без еды при 120 об/мин, чтобы получить синхронизированные нематоды L1.
2. PolyQ-опосредованные анализы нейротоксичности
- Лечение C. elegans тестовыми образцами
- Чтобы получить нематоды для анализа нейротоксичности polyQ, перенесите 300-500 синхронизированных личинок L1 HA759 в каждую лунку 48-луночного планшета с 500 мкл среды S, содержащей OP50 (OD570 0,7-0,8) и 5 мг/мл астрагалана, обычно в три реплицирующие лунки для каждой обработки.
- Запечатайте пластину парапленкой и выдерживайте при температуре 15 °C и 120 об/мин в течение 3 дней.
- Соберите нематод центрифугированием и промойте 3-5 раз буфером М9. Ресуспендируйте нематод в буфере M9 для использования в анализах выживания нейронов и предотвращения.
- Анализ предотвращения осмотических заболеваний
- Разделите непищевую тарелку NGM (9 см) на нормальную (N) и ловушку (T) зоны линией 8 М глицерина (~30 μл) посередине. Распределите линию с концентрацией 200 мМ азида натрия (~20 μл) на расстоянии ~1 см от линии глицерина, чтобы парализовать нематоды, проходящие через глицериновый барьер в зону Т.
- Перенесите ~200 нематод на зону N из трех репликационных пластин для каждой группы. Добавьте каплю 1% бутандиона (~2 мкл) в зону T (1 см от края пластины), чтобы привлечь нематод. Немедленно накройте чашку Петри крышкой и выдерживайте при температуре 23 °C в течение 90 минут.
- Оцените количество нематод в N и T зонах под микроскопом. Рассчитайте индекс избегания с помощью уравнения eq.
Индекс избегания = N / (T + N)
Где N и T — количество нематод в N и T зонах соответственно. Данные представлены в виде средних значений стандартного отклонения (SD) трех повторов, репрезентативных ± >3 независимых экспериментов.
- Проведите непарный двусторонний t-критерий для сравнения данных астрагалановой и контрольной групп.
Таблица 1:
| решение | Инструкция по приготовлению | хранение |
| 1 M CaCl2 | 111 г CaCl2 | Хранить при комнатной температуре (RT) |
| Добавьте dH2O в 1 л |
| автоклав |
| >1 M Фосфат калия (pH 6.0) | 108,3 г KH2PO4 | Хранить в RT |
| 35,6 К2ГПО4 |
| Добавьте dH2O в 1 л |
| автоклав |
| 1 M MgSO4 | 246 г MgSO4,7H 2O | Хранить в RT |
| Добавьте dH2O в 1 л |
| автоклав |
| Холестерин в этаноле (5 мг/мл) | 0,5 г холестерина | Хранить при -20 °C |
| Добавьте этанол до 100 мл |
| Не автоклав! |
| 1 M Цитрат калия (pH 6.0) | Добавьте 10,0 г моногидрата лимонной кислоты | Хранить в RT |
| Добавьте 146,75 г моногидрата трикалия лимонной кислоты |
| Добавьте dH2O в 1 л |
| автоклав |
| Раствор для следов металлов | 0,93 г динатрия ЭДТА | Хранить в темноте в RT |
| 0,345 г FeSO4,7H 2O |
| 0,1 г MnCl 2,4H 2O |
| 0,145 г ZnSO4,7H 2O |
| Добавьте 0,0125 г CuSO4,5H 2O |
| Добавьте dH2O до 500 мл |
| автоклав |
| 1 M NaOH | 4 г NaOH | Хранить в RT |
| Добавьте dH2O на 100 мл |
| Раствор отбеливателя | 0,5 мл 1 М NaOH | Подготовьте перед использованием |
| 0,5 мл 10% NaOCl |
| M9 буфер | 5 г NaCl | Хранить в RT |
| 3 г KH2PO4 |
| 6 г Na2HPO4 |
| Добавьте dH2O в 1 л |
| автоклав |
| Добавьте 1 мл 1 М MgSO4 |
| S базальный | 5,85 г NaCl | Хранить в RT |
| 6,0 г KH2PO4 |
| 1,0 г K2HPO4 |
| Добавьте dH2O к 973 мл |
| Автоклав, и охладить до ~60 °C |
| Добавьте 1 мл холестерина 5 мг/мл в этанол |
| S средний | S базальный | Хранить в RT |
| Добавьте 3 мл 1 М CaCl2 |
| Добавьте 3 мл 1 М MgSO4 |
| Добавьте 10 мл 1 М цитрата калия |
| Добавьте 10 мл раствора микропримесей металлов |
| Все компоненты прошли автоклавирование, не автоклавируются |
| 5 мг/мл астрахалан | 0,1 г астрагалана | Хранить в аликвотах при -80 °C |
| Добавьте 20 мл среды S |
| Фильтр через шприцевой фильтр 0,22 мкм |
| >200 мМ азида натрия | 1,3 г NaN3 | Хранить при 4 °C |
| Добавьте 100 мл S среды |
| 8 М Глицерин | 73,67 г глицерина | Хранить в RT |
| Добавьте dH2O на 100 мл |
| 10% бутандион | Смешайте 10 μл бутандиона с 90 μл dH2O | Магазин в RT |
| 1% бутандион | Добавьте 10 мкл бутандиона к 90 мкл dH2O | Магазин в RT |
| 1 л культуры Лурия-Бертани (LB) | 10 г NaCl | Хранить в RT |
| 10 г триптона |
| 5 г дрожжевого экстракта |
| Добавьте dH2O в 1 л |
| автоклав |
