Изучение хемоизбегающего поведения у трансгенных червей с помощью осмотического анализа избегания

Abstract

Источник: Wang, Q. et al., Z. Caenorhabditis elegans как модельная система для открытия биоактивных соединений против полиглутамин-опосредованной нейротоксичности. J. vis. Exp. (2021).

Это видео описывает анализ осмотического избегания для изучения поведения химиоизбегания в модели трансгенного червя. Поведение избегания проверяется в планшете в присутствии высокоосмотического барьера и хемоаттрактанта. Черви с функциональной потерей нейронов притягиваются хемоаттрактантом, пересекают высокоосмотический барьер и под действием обезболивающего раствора оказываются парализованными в зоне ловушки.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу 1 для рецептов решений, используемых в этом протоколе.

1. Подготовка материалов для анализа на Caenorhabditis elegans

1. Поддержание штаммов C. elegans
   1. Получите штаммы C. elegans (AM141 и HA759) и Escherichia coli (OP50 и NA22) (см. Таблицу материалов).
   2. Поддерживайте содержание нематод на пластине с нематодами для роста (NGM), засеянной E. coli OP50, при температуре 20 °C для AM141 или 15 °C для HA759.
2. Приготовление бактериальной культуры E. coli OP50
   1. Выберите одну колонию E. coli OP50 из полосовой пластины Лурии-Бертани (LB) и инокулируйте ее в 50 мл жидкой культуры LB.
   2. Инкубируйте бактерии OP50 в шейкере при 37 °C и 200 об/мин до оптической плотности ~0,5 при 570 нм (OD₅₇₀).
   3. Храните бактериальную культуру OP50 при температуре 4 °C и используйте в течение двух недель.
3. Подготовка планшетов NGM с бактериями OP50
   1. Добавьте 20 г агара, 2,5 г пептона, 3,0 г NaCl и 975 мл деионизированной воды в автоклавируемую бутылку объемом 1 л. Автоклав при 121 °C в течение 30 мин.
   2. Поставьте флакон с жидким агаром NGM на стол для охлаждения до ~60 °C, а затем добавьте следующие стерильные исходные растворы: 1 мл 1 М CaCl₂, 1 мл 1 М MgSO₄, 1 мл 5 мг/мл холестерина и 25 мл 1 М фосфата калия (pH 6,0).
   3. Налейте 20 мл NGM в стерильную чашку Петри диаметром 90 мм и оставьте пластины на столе для остывания и застывания. Держите тарелки вверх дном и дайте им высохнуть на скамейке при комнатной температуре в течение 2 суток.
   4. Нанесите 200 мкл бактериальной культуры OP50 на каждую чашку NGM и равномерно распределите стерильным стержнем для стеклянного покрытия. Закройте крышки и инкубируйте тарелки в течение ночи при температуре 37 °C.
   5. Храните планшеты NGM, засеянные OP50, в пластиковой коробке с крышкой при комнатной температуре и используйте в течение двух недель.
4. Подготовка синхронизированной по возрасту популяции C. elegans
   1. Собрать взрослых нематод в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировать при 1000 × г в течение 1 мин. Трижды промыть и повторно суспендировать нематод в буфере М9.
   2. Добавьте равный объем раствора отбеливателя и осторожно перемешивайте в течение 3-5 мин. Контролируйте отбеливание каждые 15 с под препарирующим микроскопом.
      заметка: Раствор отбеливателя перед использованием должен быть приготовлен свежим путем смешивания равных объемов 10% NaOCl и 1 М NaOH (Таблица 1).
   3. Как только большая часть нематод будет уничтожена, остановите переваривание, разбавив буфером M9. Быстро центрифугируйте для удаления надосадочной жидкости и повторно суспендируйте гранулу в буфере M9, чтобы повторить промывку три раза.
   4. Ресуспендируйте гранулу в среде S. Дайте остаткам нематоды осесть под действием силы тяжести в течение 2-3 минут, пока яйца остаются в надосадочной жидкости.
   5. Аспирируйте надосадочную жидкость в новую стерильную микроцентрифужную пробирку. Соберите яйца центрифугированием при 1000 × г в течение 1 мин.
   6. Выбросьте ~80% надосадочной жидкости и переложите яйца в стерильную колбу, содержащую 20 мл S-среды. Поместите колбу в шейкер и инкубируйте яйца в течение ночи без еды при 120 об/мин, чтобы получить синхронизированные нематоды L1.

2. PolyQ-опосредованные анализы нейротоксичности

1. Лечение C. elegans тестовыми образцами
   1. Чтобы получить нематоды для анализа нейротоксичности polyQ, перенесите 300-500 синхронизированных личинок L1 HA759 в каждую лунку 48-луночного планшета с 500 мкл среды S, содержащей OP50 (OD570 0,7-0,8) и 5 мг/мл астрагалана, обычно в три реплицирующие лунки для каждой обработки.
   2. Запечатайте пластину парапленкой и выдерживайте при температуре 15 °C и 120 об/мин в течение 3 дней.
   3. Соберите нематод центрифугированием и промойте 3-5 раз буфером М9. Ресуспендируйте нематод в буфере M9 для использования в анализах выживания нейронов и предотвращения.
2. Анализ предотвращения осмотических заболеваний
   1. Разделите непищевую тарелку NGM (9 см) на нормальную (N) и ловушку (T) зоны линией 8 М глицерина (~30 μл) посередине. Распределите линию с концентрацией 200 мМ азида натрия (~20 μл) на расстоянии ~1 см от линии глицерина, чтобы парализовать нематоды, проходящие через глицериновый барьер в зону Т.
   2. Перенесите ~200 нематод на зону N из трех репликационных пластин для каждой группы. Добавьте каплю 1% бутандиона (~2 мкл) в зону T (1 см от края пластины), чтобы привлечь нематод. Немедленно накройте чашку Петри крышкой и выдерживайте при температуре 23 °C в течение 90 минут.
   3. Оцените количество нематод в N и T зонах под микроскопом. Рассчитайте индекс избегания с помощью уравнения eq.
      Индекс избегания = N / (T + N)
      Где N и T — количество нематод в N и T зонах соответственно. Данные представлены в виде средних значений стандартного отклонения (SD) трех повторов, репрезентативных ± >3 независимых экспериментов.
   4. Проведите непарный двусторонний t-критерий для сравнения данных астрагалановой и контрольной групп.

Таблица 1:

решение	Инструкция по приготовлению	хранение
1 M CaCl2	111 г CaCl2	Хранить при комнатной температуре (RT)
	Добавьте dH2O в 1 л
	автоклав
>1 M Фосфат калия (pH 6.0)	108,3 г KH2PO4	Хранить в RT
	35,6 К2ГПО4
	Добавьте dH2O в 1 л
	автоклав
1 M MgSO4	246 г MgSO4,7H 2O	Хранить в RT
	Добавьте dH2O в 1 л
	автоклав
Холестерин в этаноле (5 мг/мл)	0,5 г холестерина	Хранить при -20 °C
	Добавьте этанол до 100 мл
	Не автоклав!
1 M Цитрат калия (pH 6.0)	Добавьте 10,0 г моногидрата лимонной кислоты	Хранить в RT
	Добавьте 146,75 г моногидрата трикалия лимонной кислоты
	Добавьте dH2O в 1 л
	автоклав
Раствор для следов металлов	0,93 г динатрия ЭДТА	Хранить в темноте в RT
	0,345 г FeSO4,7H 2O
	0,1 г MnCl 2,4H 2O
	0,145 г ZnSO4,7H 2O
	Добавьте 0,0125 г CuSO4,5H 2O
	Добавьте dH2O до 500 мл
	автоклав
1 M NaOH	4 г NaOH	Хранить в RT
	Добавьте dH2O на 100 мл
Раствор отбеливателя	0,5 мл 1 М NaOH	Подготовьте перед использованием
	0,5 мл 10% NaOCl
M9 буфер	5 г NaCl	Хранить в RT
	3 г KH2PO4
	6 г Na2HPO4
	Добавьте dH2O в 1 л
	автоклав
	Добавьте 1 мл 1 М MgSO4
S базальный	5,85 г NaCl	Хранить в RT
	6,0 г KH2PO4
	1,0 г K2HPO4
	Добавьте dH2O к 973 мл
	Автоклав, и охладить до ~60 °C
	Добавьте 1 мл холестерина 5 мг/мл в этанол
S средний	S базальный	Хранить в RT
	Добавьте 3 мл 1 М CaCl2
	Добавьте 3 мл 1 М MgSO4
	Добавьте 10 мл 1 М цитрата калия
	Добавьте 10 мл раствора микропримесей металлов
	Все компоненты прошли автоклавирование, не автоклавируются
5 мг/мл астрахалан	0,1 г астрагалана	Хранить в аликвотах при -80 °C
	Добавьте 20 мл среды S
	Фильтр через шприцевой фильтр 0,22 мкм
>200 мМ азида натрия	1,3 г NaN3	Хранить при 4 °C
	Добавьте 100 мл S среды
8 М Глицерин	73,67 г глицерина	Хранить в RT
	Добавьте dH2O на 100 мл
10% бутандион	Смешайте 10 μл бутандиона с 90 μл dH2O	Магазин в RT
1% бутандион	Добавьте 10 мкл бутандиона к 90 мкл dH2O	Магазин в RT
1 л культуры Лурия-Бертани (LB)	10 г NaCl	Хранить в RT
	10 г триптона
	5 г дрожжевого экстракта
	Добавьте dH2O в 1 л
	автоклав

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Штаммы C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Центр генетики ценорхабдита (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
Штаммы кишечной палочки
США22	Центр генетики ценорхабдита (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/NA22
ОП50	Центр генетики ценорхабдита (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
реагент
агар	Шанхайская компания EKEAR Bio-Technology Co., Ltd.	EQ1001-500G	https://www.ekear.com
Бутандион	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80042427	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb 595д0
холестерин	Сигма-Олдрич	С8667	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
глицерин	Аладдин Ко., Лтд.	G116203	https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
пептон	Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd.	050170Б	https://www.huankai.com/show/21074.html
Азид натрия	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
Гидроксид натрия	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10019718	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817< чел. /> d3d8c68ec25e6
Раствор гипохлорита натрия	Гуанчжоуский завод химических реактивов	7681-52-9	http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
Триптон	ООО «Оксоид»	LP0042B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
Дрожжевой экстракт	ООО «Оксоид»	LP0021B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
оборудование
48-луночный планшет для клеточных культур	Нест Биотехнология Ко., Лтд.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Чашка Петри 90 мм	Сангон Биотек (Шанхай) Ко., Лтд.	F611003	https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
автоклав	Панасоник	MLS-3781L-PC
Препарирующий микроскоп	ЧунЦин Оптическая Компания, Лтд.	ZSA0745	http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
Микроцентрифуга	Генная компания	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Парапленка М	Сигма-Олдрич	П7793-1ЭА	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
шейкер	Чжичэн Инк.	ZWY-2102C	http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html