Анализ раны для оценки миграционной способности мышиных миобластов в кокультуре

Аннотация

Источник: Toubat, O. et al., Моделирование паракринной неканонической Wnt сигнализации in vitro. J. vis. Exp. (2021).

Это видео описывает бесконтактный анализ заживления ран с помощью совместного культивирования для оценки миграционной способности мышиных миобластов. Это помогает понять отправку и прием сигнала паракринных неканонических сигнальных взаимодействий Wnt in vitro.

Протокол

1. Анализ раны:

(На рисунке 1 показана схематическая модель анализа)

1. Дайте вставкам O9-1 и лункам камеры C2C12 прилипнуть и размножаться в инкубаторе до тех пор, пока обе клетки не достигнут ~70-80% конфлюенции, прежде чем приступать к этой части протокола. Если клетки вырастают на >90% сливающимися, не приступайте к анализу царапин, так как клетки просто отделятся от лунки.
2. Нагрейте 1x PBS и C2C12 среду, поместив их на водяную баню при температуре 37 °C.
3. Хорошо удалите надосадочную жидкость из камеры C2C12 и промойте ячейки один раз 1x PBS. Извлеките 1x PBS и немедленно поцарапывайте ячейки стерильным наконечником для пипетки P10.
   1. Плотно проведите стерильный наконечник пипетки P10 в одном направлении, чтобы он охватывал всю длину или ширину монослоя клеток (например, справа налево, сверху вниз). Обязательно поцарапайте каждую лунку, содержащую клетки, только один раз.
      заметка: Для оптимизации результатов скреткинга скрежеты скважины разных экспериментальных условий при одинаковом уровне конфлюенции. Для этого убедитесь, что в каждой 4-камерной лунке есть ячейки для каждого требуемого экспериментального условия (например, лунка #1 с отрицательным контролем, скважина #2 с положительным контролем). Кроме того, используйте новую стерильную пипетку P10 для каждой царапины и каждый раз прикладывайте к пипетке одинаковое усилие. Не пытайтесь создать более одной царапины в каждой лунке.
   2. После царапин быстро добавьте 1 мл 1x PBS обратно в лунку с помощью наконечника для дозатора P1000. Повторите этот процесс для каждой лунки, которую вы будете поцарапать.
      заметка: Учитывая изменчивость, связанную с каждой царапиной, рекомендуется использовать несколько лунок (n = 3) для создания раны в каждом экспериментальном состоянии. Работайте быстро, так как очень важно свести к минимуму время, в течение которого ячейки находятся без 1x PBS во время этих этапов. После удаления 1x PBS из каждой лунки не следует тратить более 5 секунд на создание раны в каждой лунке.
4. После создания раны и добавления 1x PBS обратно в каждую лунку, сфотографируйте царапину с помощью светлопольного инвертированного микроскопа и используйте это изображение в качестве базового размера раны (время 0). Чтобы сделать снимк, выполните следующие действия:
   1. Включите компьютер и микроскоп (см. Таблицу материалов), нажав кнопку питания. Поместите предметное стекло на столик и поверните диск объектива до 5-кратного увеличения.
   2. Откройте программное обеспечение для обработки изображений (см. Таблицу материалов), дважды щелкнув значок программы на рабочем столе компьютера. Перейдите на вкладку «Камера» на главном экране программного обеспечения. Нажмите кнопку «Онлайн», чтобы визуализировать ячейки на вкладке AxioCam IC.
   3. Убедитесь, что светофильтр полностью вытянут, чтобы свет мог проникать на камеру и экран компьютера. Вручную переместите и/или поверните предметное стекло камеры, чтобы расположить область раны в центре изображения в реальном времени на вкладке AxioCam IC.
   4. Чтобы сделать снимк, нажмите «Прикрепить», чтобы открыть новую вкладку рядом с вкладкой AxioCam IC, содержащей изображение.
   5. Чтобы сохранить это неподвижное изображение, нажмите кнопку "Файл" в верхнем левом углу главной страницы программы | "Сохранить как | введите имя файла в поле "Имя файла". Сохраните рисунок в формате изображения Carl Zeiss (*.czi) (настройка по умолчанию) и выберите рабочий стол на панели слева, чтобы сохранить файл на рабочем столе в виде файла .czi, который можно открыть только в программе Zen lite 2012.
   6. Чтобы сохранить изображение как .tiff, нажмите файл | сохранить как | введите имя файла в поле имени файла. Сохраните рисунок как файл изображения с тегом (*.tiff), нажав кнопку «Сохранить как тип» и выбрав *.tiff из выпадающего меню.
      заметка: Формат .tiff можно открыть в любом программном обеспечении для обработки изображений.
   7. Вручную переместите предметное стекло патронника, чтобы сделать еще 2-3 снимка в других точках раны в той же лунке.
      заметка: В общей сложности это приведет к получению 3-4 неперекрывающихся изображений раны с большим увеличением в каждой лунке.
5. Удалите 1x PBS из каждой лунки и добавьте 1 мл среды C2C12.
   заметка: Будьте осторожны и не проводите пипетку слишком агрессивно при извлечении или добавлении растворов в камеру после образования раны, так как это может привести к отделению клеток от камеры. Кроме того, хорошо наклоните камеру таким образом, чтобы аспирация и повторное введение растворов могли осуществляться в углах каждой лунки, чтобы свести к минимуму разрушение монослоя ячейки.
6. Соберите систему кокультуры с луночными вставками, вручную поместив вставки, содержащие клетки O9-1, в каждую лунку камерного колодца. Осторожно вдавите вставки в лунку так, чтобы дно вставки находилось чуть выше нижележащих ячеек C2C12. Верните конструкции вставки лунок в инкубатор.
   заметка: Не допускайте физического соприкосновения нижней части вкладыша с нижележащими клетками C2C12 и их механического разрушения.
7. Дайте клеткам мигрировать в общей сложности на 9-12 часов. Чтобы определить оптимальное время миграции, проверяйте клетки через 6 ч после создания раны, а затем каждые 2-3 ч. Заканчивайте эксперимент, когда клетки в контрольных или положительных контрольных условиях начнут полностью покрывать рану
   заметка: Учитывая бесконтактный характер конструкции, вышележащую вставку не нужно удалять из скважин при проверке прогрессии миграции интервала. Миграционная изменчивость будет наблюдаться в зависимости от таких факторов, как типы клеток, используемые в этом анализе, клеточная плотность на момент создания раны, ширина созданной раны и условия эксперимента с обрабатываемыми клетками (например, нокдаун гена, добавление рекомбинантного белка). Концентрации этих реагентов следует определять экспериментально с учетом рекомендаций производителя.

Результаты

Рисунок 1: Схематическая модель анализа.Этап 1 включает в себя in vitro экспансию миобластов C2C12 и НКЦ с использованием STO фидерных клеток. Этап 2 включает в себя гальванизацию NCC и клеток C2C12 в системе совместного культивирования. Шаг 3 включает анализ раны, выполненный в основных клетках C2C12 для оценки миграционной способности клеток. Этап 4 включает иммуноокрашивание фаллоидина дл...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
C2C12 мышиная клеточная линия миобластов	АТКС	ЦРЛ-1772
Камерная скользящая система, 4-луночная	ThermoFisher Scientific	154526
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM), высокий уровень глюкозы (4,5 г/л), лглутамин (2 мМ)	Корнинг	10-017-СВ	Хранить при температуре 4 °C
Градуированные и стерильные наконечники для пипеток, 10 μл	США Сайентифик	1111-3810 (Английский)
Клеточная линия нервного гребня O9-1	Миллипора Сигма	СКК049
Фосфатно-буферный раствор (PBS), 1x, без кальция и магния, pH 7,4	Корнинг	21-040-ЧВ	Хранить при температуре 4 °C
Проницаемая опора Falcon для 24-луночного планшета с прозрачной ПЭТ-мембраной 0,4 мкМ	Корнинг	353095
Фетальная бычья сыворотка	Научный центр Фишера	В3381Э	Хранить в аликвотах 50 мл при -20 °C
Инвертированный световой микроскоп Zeiss Axio Vert.A1	Карл Цейсс АГ
Программное обеспечение для микроскопии Zen lite 2012	Карл Цейсс АГ		Программное обеспечение для обработки изображений