Иммуноферментный анализ для верификации химически связанных конъюгатов антитело-антиген

Аннотация

Источник: Volckmar, J. et al., Химическая конъюгация очищенного антитела, направленного на DEC-205, с полноразмерным белком для нацеливания на дендритные клетки мыши in vitro и in vivo. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует обнаружение химически конъюгированных комплексов антитело-антиген с помощью метода иммуноферментного анализа, или ИФА. Захваченное антитело связывается со специфическим эпитопом антигена конъюгата антитело-антиген, который впоследствии может быть визуализирован с помощью вторичного антитела, связанного с ферментом.

Протокол

1. Производство αDEC-205 из гибридомной клеточной линии NLDC-145

1. Для получения антител необходимо разморозить криоконсервированные клетки NLDC-145, продуцирующие αDEC-205 при 37 °C, на водяной бане. Расширяйте ячейки при 37 °C и 5%_CO2. Для начала выработки антител понадобятся два флакона размером 75 см² дюйма. Процедуры культивирования клеток следует проводить в защитном шкафу, чтобы обеспечить безопасные условия работы и предотвратить контаминацию культур.
   1. Ресуспендировать 1 мл размороженных клеток (1 x 10⁶ - 5 x 10⁶ клеток/мл) в 9 мл среды ISF-1 с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина (предварительно подогретого до 37 °С) в колбу для клеточных культур (25 см²). Поместите колбу горизонтально в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 °C, 5%_CO2.
   2. Культивируйте клетки при 37 °C и 5%_CO2 до 70% слияния. Обычно это должно быть достигнуто через 24 - 48 часов.
   3. После того как клетки слились на 70%, перенесите полную клеточную суспензию NLDC-145 (10 мл) в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл с помощью контроллера пипетки с пипеткой в диапазоне объемов от 1 до 10 мл. Гранулируйте клетки центрифугированием при плотности 250 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
   4. Предварительно подогреть среду ISF-1 до 37 °C на водяной бане и повторно суспендировать гранулу в 12 мл среды ISF-1 с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина. Переложите ресуспендированную клеточную суспензию в колбу для свежей клеточной культуры (75 см² ).
   5. Культивируйте и расширяйте клетки в среде ISF-1 с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C и 5%_CO2 до 70% конфлюентности и 99% жизнеспособности. Обычно это должно быть достигнуто через 48 - 72 ч.
   6. Разделите ячейки на две колбы по^{75 см 2}. Для этого сначала промойте дно колбы для клеточных культур/поверхность культивальной суспензии, чтобы удалить все клетки NLDC-145 с поверхности. Переложите по 6 мл клеточной суспензии NLDC-145 в один из двух свежих флаконов 75 см² и добавьте предварительно подогретую среду ISF-1 с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина до 12 мл.<бр/> заметка: Не обновляйте среду для культивирования клеток, так как клетки NLDC-145 будут кондиционировать среду. Перенесите клетки вместе с их средой и заполните культуру до нужного объема свежей средой. Это имеет решающее значение для жизнеспособности и максимальной выработки антител клетками NLDC-145.
   7. Расширяйте клеточные культуры при 37 °C и 5%_CO2 до примерно 70% конфлюента, что обычно достигается через 48 - 72 ч.
   8. После того, как клетки слились на 70%, перелейте по 10 мл расширенной клеточной суспензии NLDC-145 из каждого флакона размером 75 см² в один роликовый флакон PETG (полиэтилентерефталатгликоль) (1050 см²). Для этого промойте дно колбы/поверхность клеточной культуры клеточной суспензией, чтобы удалить все клетки с поверхности с помощью контроллера пипетки и пипетки объемом 10 мл.
   9. Добавьте 140 мл среды ISF-1 с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина (предварительно подогретого до 37 °C) непосредственно из флакона со средой в каждый из флаконов NLDC-145, содержащих ролики, наполнив их до отметки 150 мл><. заметка: Смотрите примечание в шаге 1.1.6.
   10. Заквашивайте роликовые бутылки при температуре 37 °C, 5%_CO2 и 25 оборотов/мин в течение трех дней.
   11. Добавьте по 150 мл среды ISF-1 с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина (предварительно подогретого до 37 °С) в каждый из флаконов NLDC-145, содержащих ролики, заполнив их до отметки 300 мл.
   12. Закваливайте роликовые флаконы, содержащие по 300 мл культуры каждая, при 37 °C, 5%_CO2 и 25 раундах/мин в течение еще трех дней.
   13. Добавьте еще 100 мл среды ISF-1 с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина (предварительно подогретого до 37 °C) в каждый из роликовых флаконов NLDC-145, тем самым заполнив их до отметки 400 мл.
   14. Заквашивайте роликовые флаконы, содержащие по 400 мл культуры каждый при 37 °C, 5%_CO2 и 25 раундах/мин в течение еще семи дней.
       заметка: В течение этой недели культура становится очень плотной (до 95% плотности), а жизнеспособность снижается (до 50%), что позволяет максимально высвобождать антитела.
2. Для очистки αDEC-205 от надосадочной жидкости культуры вливают клеточную суспензию NLDC-145 (из обоих роликовых флаконов) непосредственно в автоклавные центрифугирующие флаконы объемом 500 мл.
   заметка: Общий объем культуры должен быть собран в объеме 800 мл.
   1. Центрифугируйте культуру в течение 30 минут при 8 600 x g и 4 °C для удаления клеток и мусора.
   2. Соберите надосадочную жидкость, отбросив гранулы и объединив ее в стерильный флакон с реагентом.
      заметка: Очистку αDEC-205 можно начинать немедленно (стадия 2) или хранить надосадочную жидкость в течение короткого времени при температуре 4 °C.

2. Выделение антитела αDEC-205 из надосадочной жидкости NLDC-145

ПРИМЕЧАНИЕ: Из надосадочной жидкости NLDC-145 αDEC-205 очищается с помощью колонки из белка G Sepharose (многоразовой). Размеры колонки составляют 15 мм x 74 мм, а в каждой колонке содержится 5 мл белка G сефарозы.

1. Для приготовления и промывки колонки белка G сефарозы на верхнее отверстие колонки белка G сефарозы надевают герметичную резиновую пробку. Проколите резиновую пробку двумя стерильными канюлями (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 мм).
   1. Подсоедините шприц объемом 10 мл к одной из двух канюль и гибкую силиконовую трубку (длиной примерно 100 см, диаметром 2,5 - 3 мм) с соединительным трубкой ко второй канюле.
      заметка: Конструкция шприца/резиновой пробки является многоразовой и обеспечивает вакуум, что приводит к непрерывному потоку большого объема надосадочной жидкости культуры в колонку сефарозы белка G. С этой целью слегка оттяните поршень шприца, чтобы обеспечить непрерывный поток жидкости на следующих этапах.
   2. Промойте колонку 50 мл 0,1 М ледяной уксусной кислоты (pH 2) для удаления потенциально оставшихся антител от любой предыдущей очистки антителами. Поместите конец силиконовой трубки в бутылку с реагентом, наполненную ледяной уксусной кислотой (pH 2) 0,1 М. В результате индуцированного вакуума 50 мл 0,1 М ледяной уксусной кислоты (pH 2) по каплям протекают через колонку сефарозы белка G.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 0,1 М ледяной уксусной кислоты (pH 2) следует хранить во флаконе с реагентом или в свежезалитой стакане.
   3. Промойте колонку 100-200 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Поместите конец силиконовой трубки в наполненную PBS бутылку с реагентом или стакан. Пропустите 100-200 мл PBS по каплям через колонку сефарозы белка G.
2. Для очистки антител из надосадочной жидкости NLDC-145 загрузите в колонку 800 мл надосадочной жидкости NLDC-145 (полученной на шаге 1.2.2). Вставьте конец силиконовой трубки в флакон с реагентом NLDC-145, наполненный надосадочной жидкостью. Дайте 800 мл надосадочной жидкости NLDC-145 протекать по капле через колонку.
   1. Промойте колонку 500 мл PBS. Поместите конец силиконовой трубки в наполненный PBS флакон с реагентом или стакан. Пусть 500 мл PBS проходит по каплям через колонку.
   2. Для элюирования используйте 20 пробирок объемом 1,5 мл и пипетку по 100 мкл 1,5 М Tris-HCl (pH 8,8) в каждую пробирку объемом 1,5 мл. Снимите резиновую пробку с колонки и пипеткой внесите 1 мл 0,1 М глицина (pH 3) в верхнюю камеру колонки белка G Sepharose для выведения антитела из колонки. Соберите проточный воздух непосредственно в виде элюата в одну из подготовленных пробирок объемом 1,5 мл.
   3. Повторите этап элюирования (2.2.2.) для всех 20 пробирок (1,5 мл).
   4. Определить оптическую плотность всех фракций элюирования на длине волны 280 нм (OD₂₈₀) с помощью спектрофотометра с целью идентификации фракций, содержащих антитела.
      заметка: Используйте первую фракцию элюирования в качестве пустой.
   5. Объедините все фракции с OD₂₈₀ больше 0,5 (примерно 10 дробей).
   6. Храните белок G сефарозный столбик, заполненный 20% этанолом при температуре 4 °C.
3. Диализируйте объединенные элюции в дозе 1000 мл PBS (в стакане объемом 2000 мл) при температуре 4 °C в течение ночи с помощью диализных трубок с молекулярной массой (MWCO) 12 - 14 кДа.
   1. Разрежьте диализную трубку на кусочки по 20 см. Прокипятите диализную трубку в 500-800 мл 10 мМ ЭДТА (pH 7,5) в течение 30 минут в стакане, используя горячую пластину для удаления загрязнений. Слейте 10 мМ раствор ЭДТА (pH 7,5) и прокипятите диализную трубку в деионизированной воде в течение 10 мин.<бр/> заметка: Диализную трубку можно использовать непосредственно или хранить в 0,01% растворе азида натрия (NaN₃)/H₂O при температуре 4 °C до следующего использования.
   2. Закройте дно диализной трубки подходящей крышкой диализной трубки/цельным шарнирным зажимом и осторожно наведите элюирование антител в диализную трубку. Закройте верхнюю часть диализной трубки вторым зажимом.
   3. Закрепите верхний зажим диализной трубки на плавающей подставке, вставьте его вместе с магнитной мешалкой в стакан, наполненный PBS, и поместите стакан на магнитную мешалку.
   4. Диализируйте в течение ночи, помешивая при 4 °C.
4. Чтобы увеличить концентрацию αDEC-205, загрузите полный диализат в центробежный концентратор с мощностью 10 кДа MWCO. Откройте один зажим трубки и осторожно отпидайте весь диализат из диализной трубки в центробежный концентратор (10 кДа MWCO).
   заметка: Не касайтесь наконечником пипетки нижней части концентратора.
   1. Центрифуга в течение 30 минут при 693 x g (2 000 об/мин) и 4 °C.
   2. Загрузите в центробежный концентратор 10 мл PBS и центрифугу при 693 x g (2000 об/мин) и 4 °C до тех пор, пока конечный объем раствора антитела не составит 1-1,5 мл
      заметка: При необходимости повторите этап центрифугирования, описанный в пункте 2.4.1. , чтобы отрегулировать до нужного количества.
   3. С помощью спектрофотометра определить оптическую плотность концентрированного раствора αDEC-205 при длине волны 280 нм (наружный диаметр₂₈₀). Используйте PBS в качестве пустого.
   4. Рассчитайте концентрацию αDEC-205 по следующей формуле:
      концентрация [мг/мл] = OD₂₈₀/1,4.
   5. Отфильтруйте раствор αDEC-205 с помощью шприцевого фильтрующего блока длиной 0,22 мкм.
      заметка: Очистка αDEC-205 из супернатанта гибридомных клеток NLDC-145 также может быть достигнута с помощью FPLC (быстрой белковой жидкостной хроматографии). Очищенный αDEC-205 можно хранить при температуре 4 °C или при -18 °C для длительного хранения.

3. Химическая конъюгация OVA с αDEC-205

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимальной химической конъюгации требуется соотношение 0,5 мг белка OVA к 2,5 мг αDEC-205 (1:5). Однако это соотношение может варьироваться для других белков и антител и должно быть оптимизировано для альтернативных конъюгатов. Восстановление дисульфидных связей белка OVA осуществляется путем инкубации с 30 мМ TCEP-HCl, в результате которой сульфгидриль-группы для химической конъюгации подвергаются воздействию αDEC-205, а на этапе 3.2 необходимо ввести 240 мкл TCEP-HCl. Оба этапа, индуцированное TCEP снижение OVA (этап 3.1.) и сульфо-SMCC-активация αDEC-205 (этап 3.2.) предпочтительно должны выполняться параллельно.

1. Приготовьте свежеприготовленный раствор TCEP-HCl с концентрацией 125 мМ (pH 7,0). Взвесьте желаемое количество TCEP-HCl и растворите TCEP-HCl в 0,9 М трис-основании (pH 8,8). С помощью индикаторных полосок проверьте pH раствора TCEP-HCl 125 мМ (который должен быть нейтральным) и отрегулируйте pH с помощью основания Tris (pH 8,8).
   1. Пипеткой 200 мкл раствора белка OVA (содержащего 0,5 мг OVA) в стерильную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 240 мкл 125 мМ TCEP-HCl и 560 мкл стерильной сверхчистой воды к белку OVA с помощью пипетки до конечной концентрации 0,5 мг/мл белка OVA и 30 мМ TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 2,5 мг EndoGrade OVA (лиофилизированная) растворяют в 1 мл PBS, что дает раствор OVA 2,5 мг/мл.
   2. Инкубируйте полученный OVA/TCEP-HCl при комнатной температуре в течение 1,5 ч.<бр/> заметка: Не продлевайте этот этап инкубации.
2. Чтобы активировать αDEC-205 для конъюгации, растворите 2 мг сульфо-SMCC в 100 μл сверхчистой воды.
   заметка: Сульфо-СМХК подвержен гидролизу. Таким образом, следует быстро обрабатывать большие количества нерастворенного сульфо-SMCC или использовать доступные аликвоты в дозе 2 мг.
   1. Разведите αDEC-205 в PBS так, чтобы 2,5 мг содержалось в 900 μл.
   2. Смешайте 2,5 мг αDEC-205 (объем 900 мкл; получено на стадии 3.2.1.) и 100 мкл сульфо-SMCC (получено на стадии 3.2.) в пробирке объемом 1,5 мл, в результате чего общий объем составит 1 мл.
   3. Инкубируйте раствор αDEC-205/sulfo-SMCC в течение 30 минут при 37 °C и 550 об/мин в нагревательном блоке.
3. После такой инкубации избыток сульфо-SMCC и TCEP-HCl немедленно удаляется из растворов с помощью обессоливающих колонн (MWCO 7 кДа; объем колонки 5 мл).
   1. Открутите нижнее закрытие колонны (MWCO 7 кДа), ослабьте крышку и поместите колонну в коническую трубку объемом 15 мл.
   2. Центрифуга в течение 2 мин при 1 000 x g при комнатной температуре, чтобы удалить жидкость.
   3. Поместите колонку в свежую пробирку и снимите крышку. Медленно загружайте антитело/сульфо-SMCC и OVA/TCEP-HCl, соответственно, в центр слоя компактной смолы из одной колонки каждый.
   4. Центрифуга в течение 2 мин при 1 000 x g при комнатной температуре.
   5. Выбросьте столбцы после использования. Растворы, содержащие антитела и OVA, подготовленные к конъюгации, находятся в пробирках.
   6. Немедленно смешайте оба раствора с помощью пипетирования для конъюгации αDEC-205 и OVA.
   7. Полученную смесь αDEC-205 и OVA инкубировать в течение ночи при температуре 4°C.
4. После конъюгации избыток несвязанной OVA удаляют из раствора и концентрируют связанную αDEC-205/OVA с помощью центробежного белкового концентратора (MWCO 150 кДа).
   1. Предварительно промойте центробежный белковый концентратор (MWCO 150 кДа) путем пипетирования 12 мл PBS на колонке и центрифугирования в течение 2 минут при температуре 2 000 x g при комнатной температуре.
      заметка: При необходимости повторяют этап центрифугирования (3.4.1) до тех пор, пока через колонку не пройдет объем около 5 мл.
   2. Перед загрузкой αDEC-205/OVA в центробежный белковый концентратор сохраните 20 мкл образца неконцентрированного αDEC-205/OVA для вестерн-блоттинга. Храните эту аликвоту при температуре 4 °C до анализа.
   3. Загрузите αDEC-205/OVA в центробежный белковый концентратор с помощью пипетирования.
      заметка: Избегайте любого контакта со станиной верхней камеры центробежного концентратора.
   4. Заполните концентратор до 15 мл PBS и центрифугируйте концентратор в течение 5 минут при температуре 2 000 x g при комнатной температуре.
   5. Сохраните образец проточного потока (проточный I) для анализа вестерн-блоттинга и отбросьте оставшийся проточный поток.
   6. Заполните концентратор до 10 мл PBS и центрифугируйте концентратор в течение не менее 8 минут при температуре 2 000 x g при комнатной температуре.
   7. Сохраните образец для второго проточного потока (Flow-through II) для анализа вестерн-блоттинга и отбросьте оставшийся проток.
   8. После достижения желаемого обогащения (около 1,5 мл раствора αDEC-205/OVA следует оставить в верхней камере) осторожно отсасывайте концентрированный образец><. заметка: Если в верхней камере осталось слишком много жидкости, центрифугирование можно повторить, но оно должно быть как можно короче.
5. Определить концентрацию белка полученного αDEC-205/OVA с помощью микрообъемного спектрофотометра. Используйте PBS в качестве пустого.
6. Отфильтруйте αDEC-205/OVA с помощью шприцевого фильтрующего блока длиной 0,22 мкм.
   заметка: Для последующего анализа и экспериментов in vivo αDEC-205/OVA можно хранить при температуре 4 °C или -18 °C.

4. Проверка химического сопряжения методом ИФА

1. Выполните ИФА для дальнейшей проверки успешной химической конъюгации, приводящей к αDEC-205/OVA.
2. Покройте соответствующий 96-луночный планшет методом ИФА 100 мкл/лунка 3 нг/мкл антитела αOVA кролика в буфере для покрытия (0,1 М бикарбоната натрия (NaHCO₃) pH 9,6, разбавленного в H₂O).
   1. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 4 °C.
3. После нанесения покрытия трижды промойте пластину с помощью PBS, например, с помощью ИФА-шайбы.
4. Заблокируйте планшет пипетированием 200 μL блокирующего буфера (10% FCS в PBS) в каждую лунку планшета и инкубируйте планшет в течение 30 минут при комнатной температуре.
5. Последовательно разбавляют αDEC-205/OVA (полученную на стадии 3.6.) в соотношении 1:2 в блокирующем буфере (10% FCS в PBS) с получением разведений в диапазоне от 6 г/мл до 93,8 нг/мл αDEC-205/OVA и добавляют 100 мкл/лунку этих уменьшающихся количеств αDEC-205/OVA в лунки.
   1. Выдержать тарелку в течение 1 ч при комнатной температуре.
6. Трижды вымойте тарелку с помощью PBS, например, с помощью ИФА-мойки.
7. Добавьте 100 мкл козьего антитела αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO (разведенного до 1:2000 в блокирующем буфере (10% FCS в PBS)) в каждую лунку планшета.
   1. Выдерживать в течение 1 ч при комнатной температуре.
8. Вымойте тарелку три раза с помощью PBS, например, с помощью ИФА-шайбы.
9. Добавьте в лунки 50 мкл HRPO-субстрата. При наблюдении прозрачной цветовой реакции следует остановить реакцию добавлением 150 мкл останавливающего раствора (1М Н₂SO₄) на лунку.
10. Через 5 мин считывание поглощения на длине волны 450 нм с помощью считывателя ELISA.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Блокирующий буфер (ИФА)			10 % FBS в PBS
Колба для клеточных культур T25	Greiner Bio-One	690175	мы используем стандартные колбы для клеточных культур CELLSTAR с фильтрующей крышкой; в качестве альтернативы используем колбу для суспензионных культур (690195 )
Колба для клеточных культур T75	Greiner Bio-One	658175	мы используем стандартные колбы для клеточных культур CELLSTAR; в качестве альтернативы используем колбу для суспензионных культур (658195)
Колба для клеточных культур T175	Greiner Bio-One	661175	мы используем стандартные колбы для клеточных культур CELLSTAR; в качестве альтернативы используем колбу для суспензионных культур (661195)
Центробежный концентратор MWCO 10 кДа	Сарториус	ВС2001	Центробежный концентратор Vivaspin 20
Центробежный концентратор белка MWCO 100 кДа, 5 - 20 мл	Thermo Fisher Scientific	88532	Концентратор белка Pierce, PES 5-20 мл; мы используем концентратор Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (каталожный номер 89921), который, однако, больше не доступен
Бутылки для центрифуг	Налген	525-2314	PPCO (сополимер полипропилена) с винтовой крышкой PP (полипропилен), 500 мл; получен из VWR, Германия
Буфер для покрытия (ИФА)			0,1 М бикарбоната натрия (NaHCO3) в H2O (pH 9,6)
Обессоливающие колонны MWCO 7 кДа	Thermo Fisher Scientific	89891	Вращающиеся обессоливающие колонны Zeba компании Thermo Scientific, 7K MWCO, 5 мл
Детектирующий реагент ИФА (подложка HRPO)	Сигма-Олдрич/Мерк	Т8665-100МЛ	Система жидкого субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ)
Планшет ELISA на 96 лунок	Thermo Fisher Scientific	442404	Пластина MaxiSorp Nunc-Immuno
Эмбриональная сыворотка для теленка	ПАН-БИОтек	П40-47500	FBS Хорошее форте
Средний ХОЯТ-1	Биохром/биосвисстек	Ф 9061-01
Гибридома NLDC-145	АТКС	НВ-290	если гибридомные клетки еще не находятся под рукой, их можно получить с помощью ATCC
Овальбумин	Hyglos (через BioVendor)	321000 (Английский	EndoGrade OVA ultrapure с <0,1 ЕУ/мг
Пенициллин/стрептомицин	Thermo Fisher Scientific	15140122	Gibco Пенициллин/Стрептомицин 1000 Ед/мл; в качестве альтернативы можно использовать Gibco Пенициллин/Стрептомицин 5000 Ед/мл (15070-063)
ПЭТГ полиэтилентерефталатгликоль роликовые флаконы для клеточной культуры	Монахиня в пробирке	734-2394 (Английский)	стандартный PDL-покрытие, вентилируемый (1,2X), 1050 см², объем 100 - 500 мл; получен из VWR, Германия
Индикаторные полоски pH	Мерк	109535	Полоски индикатора pH 0-14
Поликлональные антитела αrat-IgG+IgM-HRPO для коз (ИФА)	Иммуноисследования Джексона	112-035-068 (Английский	получено в Дианове, Германия; использовано в 1:2000 для проведения ИФА
Поликлональные αЯЙЦЕКЛЕТКИ кролика (ИФА)	Абкам	АБ181688	Используется при концентрации 3 нг/мкл
Белок G Сефарозный столбик	Merck/Millipore	П3296	5 мл белка G сефарозы, Fast Flow упаковываются в пустую колонку PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
Резиновая заглушка	Омнилаб	5230217	Резиновые пробки DEUTSCH & NEUMANN (нижняя Φ 17 мм; верхняя Φ 22 мм)
Силиконовая трубка	Омнилаб	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (внутренняя Φ 1 мм; внешняя Φ 3 мм)
Стройный-быстрый			мы использовали обычный шоколад Slim-Fast, который можно свободно купить в аптеке, так как в этом подходе к вестерн-блоттингу он дал лучшие результаты, чем сухое молоко
Остановочный раствор (ИФА)			1М H2SO4
Сульфо-СМХК	Thermo Fisher Scientific	No 22322	Пирсовый сшиватель Sulfo-SMCC; в качестве альтернативы используйте каталожный номер A39268 (10 x 2 мг)
Шприцевой фильтрующий блок 0,22 мкм	Merck/Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Шприцевой фильтрующий блок, 0,22 мкм, PVDF, 33 мм, гамма-стерилизованный
Шприц 10 мл	Омнилаб		Одноразовые шприцы Injekt® Solo B.Braun
Стериканские® канюли	Б. Браун		Sterican® G 20 x 1 1/2"; 0,90 x 40 мм; желтый
TCEP-HCl	Thermo Fisher Scientific	А35349
Соединитель трубки	Омнилаб		Миниатюрные трубчатые соединители Kleinfeld для силиконовой трубки

) )