Кометный анализ для выявления повреждений ДНК в клетках

Аннотация

Источник: Ji, Y., et al. Высокопроизводительный кометный анализ для оценки повреждений клеточной ДНК. J. Vis. Exp. (2022).

Видео демонстрирует анализ кометы для обнаружения повреждений ДНК после воздействия вредных веществ. В щелочных условиях ДНК раскручивается и денатурируется, а при электрофорезе неповрежденная и поврежденная ДНК по-разному мигрирует в агарозном геле, образуя структуру в форме кометы. Медленно мигрирующая неповрежденная ДНК образует круглую голову кометы, в то время как быстро мигрирующие поврежденные фрагменты ДНК образуют удлиненный хвост кометы.

Протокол

1. Подготовка материалов для анализа комет

1. Подготовка предметных стекол для микроскопа
   1. Налейте 1% (w/v) нормальной температуры плавления агарозы [растворенную в воде двойной дистилляции (ddH₂O)] в пробирку объемом 50 мл и разогрейте в микроволновой печи, чтобы агароза растворилась в ddH₂O. Хранить при температуре 37 °C, чтобы предотвратить затвердевание перед нанесением покрытия. Если произойдет застывание, выбросьте и приготовьте свежий.
   2. Предварительно нанесение слоя на предметные стекла микроскопа путем погружения их в пробирку объемом 50 мл, содержащую агарозу с нормальной температурой плавления 1% (w/v).
   3. Быстро протрите обратную сторону слайдов после погружения в слайды.
      заметка: Если не протереть должным образом обратную сторону предметных стекол, фоновый шум слайдов во время этапа анализа с помощью микроскопа.
   4. Пометьте предметное стекло с покрытием перманентным маркером в правом нижнем углу матового участка (рисунок 1A). Это показывает, на какую сторону предметного стекла нанесено предварительное покрытие.
   5. Дайте агарозе застыть и высохните в течение ночи при комнатной температуре.
   6. Заверните высушенные слайды в папиросную бумагу и храните их в коробке.

2. Подготовка образцов

1. Культивируемые клетки
   заметка: Во-первых, обработайте клетки повреждающим агентом (агентами) перед началом анализа кометы. Затем выполните следующие действия.
   1. Если клетки адгезивные, трипсинизируйте клетки, чтобы высвободить их из колбы для клеточных культур или чашек Петри для клеточных культур в месте соответствующего слияния клеток. Нейтрализуйте трипсин путем добавления сывороткосодержащих сред.
   2. Переложите клетки в пробирку объемом 50 мл, центрифугируйте (например, для HaCaTs центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре), аккуратно удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл PBS в клеточную гранулу.
   3. Выполните подсчет клеток.
   4. Перенесите 30 000 клеток в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при давлении 7 607 x g в течение 5 минут при 4 °C.
   5. Аккуратно удалите надосадочную жидкость и храните клеточную гранулу на льду в темноте перед проведением анализа кометы.
      заметка: Клетки должны регулярно проверяться на контаминацию микоплазмой перед проведением анализа комет, чтобы предотвратить, среди прочего, образование артефактного повреждения ДНК и измененную реакцию на повреждение ДНК. Условия центрифугирования могут быть изменены по мере необходимости, в зависимости от типа используемой ячейки.
2. Подготовка культивируемых клеток к анализу репарации
   1. Культивирование клеток в колбе для клеточных культур или чашках Петри.
   2. Промойте клетки 1 мл PBS дважды перед обработкой клеток повреждающими агентами (например, для клеток BE-M17 обрабатывайте 50 мкМ H₂O₂ в течение 20 минут) на льду, чтобы предотвратить восстановление во время лечения.
   3. Аккуратно промойте клетки 1 мл PBS дважды, чтобы удалить остаточные повреждающие вещества.
   4. Повторно введите среду для культивирования клеток и дайте клеткам восстановиться в течение различной продолжительности (например, 0 мин, 30 мин, 2 ч, 6 ч, 24 ч и 30 ч) в увлажненном инкубаторе (37 °C, 5%_CO2).
   5. В каждый момент времени собирайте 30 000 клеток в среду для культивирования клеток, содержащую 10% диметилсульфоксид (ДМСО), и храните их при температуре -80 °C.
   6. Перед проведением анализа комет быстро разморозьте клетки при 37 °C на водяной бане и центрифугируйте их при 7607 x g в течение 5 минут при 4 °C.
   7. Удалите надосадочную жидкость и храните клеточную гранулу на льду перед проведением анализа (т.е. с шага 3).

3. Лизис клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры на льду.

1. Используйте 12 000 клеток или 2,5 мкл цельной крови на один гель.
2. Приготовьте в микроволновой печи растворенную в PBS агарозу с низкой температурой плавления 0,6% (w/v) и поместите на водяную баню при температуре 37 °C, чтобы предотвратить ее затвердевание.
3. Пометьте матовый конец предварительно покрытых предметных стекол именем исследователя, датой и информацией о лечении с помощью перманентного маркера или карандаша.
4. Поставьте охлаждающую пластину на плоскую скамью и вставьте два замороженных охлаждающих пакета в выдвижной ящик под металлической поверхностью (как показано на рисунке 2).
5. Поместите предметные стекла на охлаждающую пластину и дайте предметным стеклам предварительно охладиться в течение 1-2 минут, прежде чем добавлять агарозные ячейки с низкой температурой плавления 0,6% (w/v).
   заметка: Если оставить предметные стекла на охлаждающей пластине более чем на 1-2 минуты, на поверхности предметного стекла может образоваться конденсат из-за влажности окружающей среды. Это может сделать агарозные гели с низкой температурой плавления менее стабильными на предметных стеклах.
6. Диспергируйте гранулу (шаг 2.2.7) с помощью вортекса. Убедитесь, что из гранулы удалена вся надосадочная жидкость. Поместите пробирки с образцами (содержащие гранулированные клетки) сразу же на лед.
   заметка: При помещении пробирок с образцами в центрифугу поместите их шарниром наружу так, чтобы гранула собиралась на этой стороне пробирки. Иногда гранулу трудно разглядеть, и ее легко сместить во время удаления надосадочной жидкости. Центрифугирование с крышкой пробирки в такой ориентации позволит узнать, где будет находиться клеточная гранула.
7. Повторно суспендируйте клеточную гранулу 200 мкл 0,6% агарозы с низкой температурой плавления (LMP agarose) и перемешайте путем пипетирования вверх и вниз без образования пузырьков. Затем быстро перенесите 80 мкл агарозных клеток, содержащих LMP, на охлажденное предметное стекло и быстро наложите покровное стекло на гель.
8. Дайте гелю застыть на охлаждающей пластине в течение 1-2 минут.
9. Тем временем приготовьте 500 мл рабочего раствора буфера для лизиса (табл. 1) и вылейте его в чашку для лизиса (рис. 3).
10. После того, как гели схватятся, быстро снимите покровные стекла, осторожно удерживая предметное стекло между большим и указательным пальцами, и сдвинув покровное стекло с геля.
11. Поместите слайды с образцами внутрь держателя слайда (все черные «точки» на предметных стеклах должны быть обращены в одном направлении, когда они помещены в носитель) (рисунок 1B), а затем поместите держатель предметного стекла внутрь чашки для лизиса (рисунок 3).
12. Закройте крышку формы для лизиса и оставьте чашку для лизиса в холодильнике на ночь при температуре 4 °C или 30 минут при комнатной температуре, в зависимости от того, что лучше всего подходит для графика работы оператора.

4. Электрофорез

1. Осторожно снимите держатель слайда с чашки для лизиса. Следите за тем, чтобы не потревожить гели.
2. Аккуратно поместите держатель слайдов в форму для мытья посуды, предварительно загруженную ледяным ddH₂O и оставьте на 30 минут, убедившись, что слайды полностью покрыты ddH₂O.
3. Вставьте замороженный охлаждающий пакет внутрь выдвижного ящика под бак для электрофореза для поддержания оптимальной буферной температуры.
4. Осторожно добавьте ледяной рабочий раствор для электрофореза (табл. 1) в бак для электрофореза и перенесите держатель ползуна в бак для электрофореза. Расположите предметные стекла так, чтобы их прозрачные части с клеточными, содержащими гели (т.е. НЕ матированные/маркирующие концы) указывали на катод (красный электрод).
5. Оставьте предметные стекла в резервуаре для электрофореза на 20 минут, чтобы ДНК расслабилась и расслабилась. На этом этапе не выключайте источник питания.
6. При необходимости вставьте новый охлаждающий пакет для максимального охлаждения.
7. Проведите электрофорез в течение 20 минут при напряжении 1,19 В/см или в любых других условиях, которые были оптимизированы.
   заметка: Для каждой лаборатории рекомендуется оптимизация условий работы электрофореза и объема буфера. Использование только одного носителя слайда во время электрофореза не вызывает какого-либо влияния слайдов на сопротивление буфера для электрофореза, и авторы не увидели существенного влияния в напряжении или токе при изменении количества слайдов.
8. Выключите источник питания, осторожно извлеките держатель предметного стекла из резервуара для электрофореза и дайте ему стечь на папиросной бумаге в течение 30 секунд.
9. Поместите держатель предметного стекла в чашку, содержащую нейтрализационный буфер (Таблица 1). Оставьте на 20 минут.
10. Снимите держатель слайда с чашки для нейтрализации, поместите его в форму для мытья с ледяным ddH2O и оставьте на 20 минут.
11. Извлеките держатель слайдов из воды и дайте предметным стеклам высохнуть в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 1 часа или при комнатной температуре в течение ночи, или не высыхайте, в зависимости от графика оператора><. заметка: Если на шаге 4.11 нет высыхания, выполните этап окрашивания с 5.2.

5. Окрашивание йодидом пропидия (PI)

1. Переложите держатель для слайдов в миску с ледяным ddH₂O для увлажнения слайдов и оставьте на 30 минут.
2. Поместите носитель предметного стекла в чашку для окрашивания, содержащую 2,5 мкг/мл раствора йодида пропидия.
   заметка: Йодид пропидиума светочувствителен, поэтому обрабатывайте его в затемненном месте. Он также токсичен.
3. Закройте крышку формы для окрашивания и выдержите ее 20 минут в темноте при комнатной температуре.
4. Переложите держатель слайдов в отдельную посуду и вымойте его ледяным ddH₂O в течение 20 минут.
5. Снимите держатель предметного стекла с чашки и полностью высушите его в темноте, либо в инкубаторе при температуре 37 °C, либо при комнатной температуре, в зависимости от графика или предпочтений оператора.
6. Когда слайды полностью высохнут, извлеките их из держателя слайдов и храните в коробке для слайдов в темноте до тех пор, пока они не будут готовы к анализу изображений.
   заметка: Слайды останутся читаемыми в течение неограниченного времени и при необходимости могут быть повторно окрашены.

6. Оценка комет и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Термин "комета" происходит от изображений поврежденных клеток при рассмотрении под микроскопом после проведения анализа (Рисунок 4). В условиях электрофореза ДНК в неповрежденных клетках в основном не мигрирует, а остается в сфероиде, называемом «головой» кометы. Однако наличие разрывов нитей позволяет ДНК клетки мигрировать из головы и формировать «хвост», что приводит к появлению кометы (Рисунок 4). Чем больше ДНК в хвосте, тем больше повреждений присутствует.

1. Включите флуоресцентный микроскоп с фильтром PI (красный) (λ = 536/617 нм) и программным обеспечением для оценки комет.
2. Добавьте каплю воды с помощью пастеровской пипетки в гель и накройте покровным стеклом.
3. Поместите предметные стекла в флуоресцентный микроскоп и «забейте» кометы.
   заметка: Скоринг — это средство, с помощью которого оцениваются кометы, чтобы определить количество повреждений, присутствующих у каждой кометы. В широком смысле, это может быть достигнуто с помощью двух подходов, в соответствии с предпочтениями пользователя: либо на глаз (измеряя размер комет по шкале от нуля до четырех), либо с помощью свободного или коммерчески доступного программного обеспечения30. Как правило, оба подхода оценивают размер хвоста кометы, хотя можно определить различные конечные точки, связанные с кометой. Если вы используете программное обеспечение, нажмите на середину головы кометы и подождите, пока программное обеспечение автоматически обнаружит комету, а затем оценит выбранную конечную точку (рисунок 4).
4. Оцените 50 комет на гель и 100 комет на образец (т.е. каждый образец соответствует различным методам лечения, повреждающим ДНК, или их репликам).
5. Повторите эксперименты (n = 2) или утройте эксперименты (n = 3).
   заметка: Если проводится только n=2 повторных экспериментов, статистический анализ не может быть выполнен, но если n=3, то проводится тест нормальности Д'Агостино. Большинство данных анализа комет не проходят тест на нормальность. В этом случае используйте непараметрический критерий (критерий Краскела-Уоллиса с критерием множественных сравнений Данна, а критерий Манна-Уитни со значением p < 0,05).

реагент	Складское решение	Рабочее решение
Буфер для лизиса	100 мМ Na2EDTA, 2,5 М NaCl и 10 мМ Tris Base в ddH2O; регулируйте pH до 10 с помощью 10 М NaOH	1% Triton X-100 в лизисном стоковом растворе
Буфер для электрофореза	10 М NaOH и 200 мМ Na2ЭДТА в ddH2O	300 мМ NaOH и 1 мМ Na2ЭДТА; pH > 13
Буфер нейтрализации	0,4 М Tris Base в ddH2O; отрегулировать pH до 7,5 с HCl
Буфер для окрашивания	1 мг/мл йодида пропидиума	2,5 мкг/мл йодида пропидия в ddH2O

Таблица 1: Состав реагентов, используемых в высокопроизводительном щелочном кометном анализе (HTP ACA). Показаны исходные и рабочие концентрации буферов для лизиса, электрофореза, нейтрализации и окрашивания.

Результаты

Рисунок 1: Репрезентативные изображения предметного стекла для анализа комет и штатива HTP (держатель предметного стекла микроскопа). (A) Для правильной ориентации предварительно покрытая поверхность предметного стекла микроскопа распознается по черной точке в правом углу предметного стекла микроскопа. (B) Изображение штатива HTP показывает, как слайды удерживаются в плотной вертикальной ориентации, ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
22 x 22 мм стеклянные покровные стекла	Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмптон, США	631-0124 (Английский)
Флуоресцентный микроскоп в комплекте с камерой	Zeiss, Йена, Германия
Система пробирного анализа комет HTP	Наука о тесаке	КОМПАК-50
Кератиноциты человека (HaCaT)	Коллекция американских типовых культур (ATCC), Манассас, Вирджиния, США	Прекращено	Можно приобрести у другого компания ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001
Перекись водорода (H2O2) 30% в воде	Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмптон, США	БП2633-500
Программное обеспечение для анализа изображений и данных	Перцептивный инструмент, Бери-Сент-Эдмундс, Англия, < /> Великобритания	125525	Бесплатное программное обеспечение для анализа изображений is доступен, например, ImageJ
Низкая температура плавления Agarose	Invitrogen Уолтем, штат Массачусетс, США	П4864
Na2 ЭДТА (динатрий<бр /> этилендиаминтетрауксусная кислота)	Сигма Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	Е5134
NaCl (хлорид натрия)	Сигма Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	С7653
Nanopure Infinity Сверхчистая вода<бр /> Система (Barnstead Nanopure)	Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	Д11901	Сверхчистая вода (16 МОм см^{-1} )
NaOH (гидроксид натрия)	Сигма Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	Е5134
Нормальная температура плавления Агароза	Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмптон, США	16520100	Для предварительного нанесения покрытия на предметные стекла
Пропидий йодид (1,0 мг/мл в воде)	Сигма Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	12-541БП486410МЛ
Микроскоп с одинарным матовым стеклом Слайды	Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмптон, США	12-541В
Слайд-бокс	Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмптон, США	Тел.: 03-448-2	Светонепроницаемый, для защиты клеток от образование случайного повреждения (согласно широко распространенному мнению) и предотвратить выцветание флуоресцентного краска
Скользящая охлаждающая пластина	Тесак Научный, Регби, Англия, < /> Великобритания	CSL-CHILLPLATE
Лечебная посуда	Тесак Научный, Регби, Англия, < /> Великобритания	STAINDISH4X
Трис-база	Сигма Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	93362
Тритон Х-100	Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмптон, США	БП151-500
Трипсин ЭДТА (0,5%)	Invitrogen Gibco, Уолтем, штат Массачусетс, США	15400054
Вертикальный держатель слайдов	Тесак Научный, Регби, Англия, < /> Великобритания	КОМПАК-25